《Journal of Medicinal Chemistry》：Orally Bioavailable Cyclin A/B RxL Inhibitors: Optimization of a Novel Class of Macrocyclic Peptides That Target E2F-High and G1–S-Checkpoint-Compromised Cancers
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本文报道了一类创新的大环肽类Cyclin A/B RxL抑制剂，通过优化其药物样性质及口服生物利用度，成功获得临床前候选化合物。该抑制剂通过阻断细胞周期蛋白A/B与含RxL基序底物的相互作用，选择性杀伤E2F通路高活性和G1–S检查点受损的肿瘤细胞，并在口服给药的小细胞肺癌异种移植模型中实现肿瘤消退。其发现标志着针对胞内蛋白-蛋白相互作用（PPI）的口服大环肽药物开发取得重要进展。
针对Cyclin A/B的口服生物可利用大环肽抑制剂的发现与优化
口服肽类药物研发挑战与策略
传统的药物研发通常聚焦于具有明确结合口袋的靶点，这些靶点易被遵循Lipinski“五规则”的小分子所靶向。然而，许多驱动疾病的关键蛋白-蛋白相互作用（PPI）界面通常较大、平坦且疏水，导致传统小分子难以有效干预，常被视为“不可成药”靶点。大环肽因其结构灵活性和可模拟天然底物的能力，在靶向此类PPI方面展现出巨大潜力。然而，开发能够有效跨越肠道屏障和细胞膜、靶向胞内蛋白的口服大环肽药物，是当前该领域面临的核心挑战。针对这一问题，研究人员总结了基于性质的药物设计原则，例如调控极性表面积（TPSA）、氢键供体/受体（HBD/HBA）数量、可旋转键数量（#RotB）和脂水分配系数（LogD）等，以改善大环肽的渗透性和口服生物利用度。
Cyclin A/B作为治疗靶点
细胞周期进程由不同的Cyclin（细胞周期蛋白）/CDK（细胞周期蛋白依赖性激酶）复合物精确调控。Cyclin A和Cyclin B分别在S期和G2/M期起关键作用。它们通过与含有“RxL”短序列的底物蛋白的疏水性表面（HP）结合，从而招募底物（如转录因子E2F）和调节因子，促进CDK的催化活性。研究表明，通过干扰Cyclin A与含RxL的底物（如p27）的相互作用，可以特异性抑制E2F通路高活性、视网膜母细胞瘤蛋白（Rb）功能失调的癌细胞增殖，而对正常细胞影响较小。然而，早期的RxL结合位点抑制剂常因依赖带正电荷的氨基酸与靶点形成盐桥，导致细胞膜渗透性差，难以产生有效的细胞抑制活性。直接抑制CDK激酶活性是另一种已被验证的抗癌策略，但其常因激酶结构域的高度同源性导致脱靶毒性和耐药性问题。因此，开发靶向Cyclin A/B的RxL结合位点、具有新型作用机制的抑制剂极具吸引力。
先导化合物2的不足与优化策略
研究团队先前报道了第一类具有被动渗透性、可结合Cyclin A和Cyclin B、并选择性杀伤E2F高活性癌细胞的大环肽。其中，先导化合物2通过腹腔注射给药，已在多种小细胞肺癌（SCLC）细胞系来源的异种移植模型中证明了其体内抗肿瘤活性。然而，化合物2的口服生物利用度仅为2%，限制了其作为口服药物的开发潜力。为了开发口服生物可利用的Cyclin A/B抑制剂，研究团队制定了明确的优化目标：一是将口服生物利用度提高至≥20%；二是通过提高细胞活性（目标GI50< 20 nM）来降低所需的暴露量阈值，同时避免血浆蛋白结合率过高。
结构优化与构效关系研究
基于化合物2与Cyclin A的复合物结构模型，研究人员确定了三个关键的优化区域：（1）苯丙氨酸（Phe）残基的2-位取代基（红色区域），用于调节理化性质；（2）连接赖氨酸侧链和苯丙氨酸的“桥联”残基（蓝色区域），可替换为不同结构以移除极性原子；（3）N端酸帽结构（绿色区域），可替换以解决潜在的代谢稳定性问题。
早期的结构-活性关系（SAR）研究发现，用酯键（-O-）或N-甲基化的酰胺键（-NMe-）替换桥联残基中的酰胺键（-NH-）能显著改善MDCK细胞的被动渗透性（Papp）。同时，将原始的螺环酸帽替换为二氟环丁基酸帽，改善了化合物的溶解度，且更耐氧化代谢。
进一步的优化发现，将桥联残基完全替换为烷基链形成“延长套索”结构（如在化合物20、22中所示），并结合Nε-赖氨酸的N-甲基化（如在化合物22中），能同时提高生化与细胞活性以及渗透性。对得到的优势骨架化合物24（即化合物22氢化双键后的衍生物）进行苯丙氨酸2-位取代基的多样化研究，发现了吡啶酮-醚类取代基（如化合物29）能带来意外的渗透性优势。
关键化合物33的发现与性质表征
在吡啶酮-醚系列的基础上，通过烷基链扫描优化，最终确定了化合物33（甲基醚被环丙基醚取代）。化合物33在保持优异细胞活性（对NCI-H1048细胞的GI50为15 nM）和渗透性（MDCK Papp = 13.2 × 10–6cm/s）的同时，将小鼠的口服生物利用度大幅提升至27.2%，并达到了超过GI50的游离药物血浆暴露水平。
化合物33对Cyclin A和Cyclin B显示出纳摩尔级的强效结合（SPR测定的KD值分别为2.7 nM和1.0 nM），且对Cyclin E的选择性超过12倍。与先导化合物2相比，化合物33成功将氢键供体（HBD）数量从4个减少到2个，并将LogD从5.54降低到3.86，显著改善了其成药性。
计算对接模型表明，化合物33的核心骨架与Cyclin A的RxL结合位点形成关键氢键，所有未参与靶标相互作用的酰胺键均被烷基化以降低极性。优化后的取代基均未与结合口袋产生空间冲突。
体内药效与药代动力学评价
在NCI-H69和NCI-H446两种SCLC异种移植小鼠模型中，口服给药化合物33展现了剂量依赖性的强效抗肿瘤活性。在NCI-H69模型中，每日两次（BID）口服50 mg/kg的化合物33可导致肿瘤平均消退40%。在更耐药的NCI-H446模型中，高剂量组（100 mg/kg，每日三次）也实现了显著的肿瘤生长抑制（80%）和消退。
在30 mg/kg和100 mg/kg口服剂量下，化合物33的暴露量呈线性增加，表明其具有良好的剂量-暴露关系。所有治疗组均耐受性良好，体重下降未超过10%。药代动力学研究显示，化合物33在小鼠、大鼠、犬和迷你猪中均表现出中等至高的血浆清除率，口服生物利用度在小鼠（27%）、大鼠（17%）和犬（23%）中高于17%，在迷你猪中较低（6.2%）。
临床前安全性评价
化合物33在包含489个激酶的筛选面板中显示出干净的谱图，符合其独特的作用机制。此外，在一系列安全药理学功能面板（包括G蛋白偶联受体、离子通道、酶和转运体）的测试中，最高10 μM浓度下也未观察到明显的脱靶活性。然而，化合物33对细胞色素P450（CYP）酶系中的CYP3A4和CYP2D6表现出一定程度的可逆性抑制，并对CYP3A4存在潜在的不可逆抑制风险，这提示未来在临床开发中需关注潜在的药物-药物相互作用。
结论
综上所述，本研究成功地将一个具有概念验证价值的腹腔注射给药先导化合物（化合物2），通过系统的基于结构和性质的优化，转化为一类具有口服生物可利用性的新型Cyclin A/B RxL抑制剂。其中，化合物33展现出优异的体外活性、良好的药代动力学特性以及在SCLC异种移植模型中的口服体内疗效。这项工作充分展示了跨规则五（bRo5）化学空间、通过合理药物设计开发口服大环肽以靶向胞内蛋白-蛋白相互作用的可行性。该研究成果直接推动了相关临床候选化合物（CID-078）的发现，后者目前正在一项针对SCLC、三阴性乳腺癌或携带RB1突变实体瘤患者的I期临床试验（NCT06577987）中进行评估，标志着Cyclin A/B抑制作为一种治疗策略已进入临床开发阶段。
