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本文系统性阐述了实现高产率、高保真度mRNA-DNA杂合折纸纳米结构（mRNA–DNA hybrid origami）的关键设计原则与标准化合成方案。研究通过使用成熟的萤火虫荧光素酶（fLuc）、增强型绿色荧光蛋白（EGFP）和mCherry的mRNA作为支架，设计了五种不同尺寸、形状、交叉（crossover）几何构型和堆积密度的结构。研究发现，非对称A型交叉、富含单价阳离子（如Na+）的缓冲液以及中等温度退火是抑制RNA降解、避免动力学捕获并适应RNA-DNA螺旋几何结构的关键。原子力显微镜（AFM）表征证实了所获纳米结构具有与DNA折纸相当的纳米级精度和单分散性。此项工作为整合DNA的结构可编程性与RNA的生物功能潜力，开发用于基因递送和纳米治疗的新一代平台奠定了坚实基础。
引言背景：融合DNA与RNA优势的纳米平台
核酸折纸技术通过将一条长单链（支架）与互补的短链（订书钉）碱基配对，折叠成复杂三维结构，彻底改变了分子纳米技术。DNA折纸凭借其明确的设计原则和合成条件，已成功应用于构建纳米机器人、精密测量系统和生物传感器。然而，将RNA整合到此类架构中展现出独特的潜力：RNA不仅能作为结构支架，更能作为功能性生物分子，携带编码区、适配体、核酶或调控元件。将DNA的可编程性与RNA的生物功能相结合，有望为基因递送、合成生物学和响应性治疗开启下一代纳米结构的大门。
RNA-DNA杂合折纸使用长RNA支架和DNA订书钉进行折叠，既能利用丰富的DNA设计生态系统，又能保留RNA的生物角色。先前的研究已证明杂合结构可以合理产率折叠，并展现出比简单双链体更高的稳定性。其中，信使RNA（mRNA）作为一种重要的治疗性和功能性生物分子，在基础研究到生物体水平免疫调节和疫苗接种等领域应用广泛。将mRNA作为核酸折纸的支架，可能为基因递送系统带来前所未有的可编程性和多功能性，克服当前在靶向特异性和化学修饰方面的局限。
然而，在mRNA支架折纸成为可行治疗平台之前，必须解决多重障碍：首先，领域内缺乏稳健的RNA-DNA杂合折纸设计原则，使得高产率组装多样化结构具有挑战性；其次，RNA的固有特性（如C2'-羟基使其在高温和高浓度二价阳离子条件下易发生自溶和降解）阻碍了DNA折纸规则的直接移植；第三，RNA比DNA更容易陷入“动力学陷阱”，在退火过程中错误折叠成不需要的二级结构；最后，A型RNA与B型DNA之间的构象差异使得交叉排布、螺旋参数等设计特征难以直接从DNA转换到RNA或RNA-DNA杂合物。
mRNA-DNA杂合折纸的设计与表征
本研究合成了一系列紧凑的mRNA-DNA杂合折纸纳米结构，并确定了实现高产率折叠的关键设计和组装参数。这些杂合物整合了DNA折纸的结构可编程性和mRNA的功能潜力。
交叉模式设计
研究首先分离了订书钉交叉几何形状对折纸构象的影响，以测试DNA折纸的交叉能否直接应用于mRNA-DNA杂合物。所有结构均按照既定的RNA折纸规则，为A型螺旋（每圈11个碱基对）而设计。评估了典型DNA折纸（21-32 bp/交叉）的中等A型交叉密度（fLuc和EGFP为33 bp）是否能达到与先前RNA-DNA折纸中使用的更密集（21 bp）或更稀疏（44 bp，mCherry为44 bp）交叉相当的稳定性。同时，对比了垂直双交叉（fLuc）与对角交叉（mCherry），以测试针对A型几何形状定制交叉的重要性。fLuc结构采用了源自常规DNA折纸的对称、垂直A型双交叉，而mCherry 6HB则采用了源自RNA折纸的非对称、对角交叉。尽管垂直交叉在DNA折纸中常见，但它们未考虑RNA-DNA杂合双链体相对于B型DNA更陡的轴向倾角，可能引入扭转和变形。为此，在EGFP折纸中，我们通过引入T环插入物来修饰A型双交叉，以增强螺旋间的灵活性并补偿潜在的内扭转。
共同结构特征
尽管交叉模式不同，但所有杂合物都纳入了设计元素来管理重复的支架3' poly(A)尾并减少平末端聚集。每个结构都包含一个120 bp的AT“尾巴”，通过将3' poly(A)片段与四个30 nt的poly(T)寡核苷酸（fLuc 6HB和fLuc 24HB）或六个20 nt的poly(T)寡核苷酸（EGFP 8HB矩形、EGFP 8HB圆柱体和mCherry 6HB）杂交而形成，以防止poly(A)尾的非特异性相互作用。此外，所有边缘订书钉都带有5T单链延伸，以最大限度地减少平末端堆积和颗粒间聚集。
计算验证
为了预测和验证设计原则，我们使用SNUPI和oxDNA对每个折纸在严格的A型、严格的B型和中间构象下进行了分子动力学模拟。静态SNUPI分析显示，所有杂合折纸均形成了整体刚性的结构，仅在螺旋束边缘具有与DNA折纸相当的适度灵活性。模拟结果揭示了A型、B型和杂合几何形状之间的显著差异，突显了交叉设计对结构完整性的影响。例如，fLuc折纸的平衡结构在B型模拟下与预期设计最吻合，但在A型或杂合模拟下一致性较差。这些结果表明，垂直交叉在RNA-DNA杂合物中引入了内部扭转。这种效应在fLuc 6HB中很明显，在SNUPI杂合和oxDNA A型模拟中出现了两个“关节”，而在oxDNA B型模拟中则没有，表明正交双交叉导致了扭转变形。尽管增加螺旋间灵活性减少了这种变形，但并未完全恢复DNA-DNA折纸中可实现的结构完整性，如EGFP 8HB的内折所示。相比之下，采用非对称对角交叉设计的mCherry 6HB表现出最小的结构变形，突出了对角交叉在适应RNA-DNA双链体更大轴向倾角方面的优势。
总之，这些发现强调RNA-DNA螺旋具有独特的几何约束，必须在杂合折纸设计中明确考虑。开发针对A型几何形状的精炼交叉策略对于实现高保真、无扭转的mRNA-DNA杂合纳米结构至关重要。
合成参数优化
在从计算上定义了交叉几何形状和核酸构象如何影响杂合折纸结构后，接下来研究了合成条件应如何从常规DNA折纸方案进行调整。
阳离子优化
我们首先测试了阳离子种类和浓度的作用，因为单价和双价阳离子（包括Na+和Mg2+）可减少静电排斥，并广泛用于促进DNA折纸折叠。然而，高浓度的MgCl2可能不适合mRNA支架，因为RNA的A型几何结构和C2'-羟基使其在高浓度二价阳离子条件下对自溶敏感。为了确定最佳条件，我们在不同浓度的NaCl和MgCl2下合成了mRNA-DNA杂合物。琼脂糖凝胶电泳（AGE）显示，在DNA折纸典型Mg2+水平（5-20 mM）下，fLuc 6HB和fLuc 24HB的结构条带微弱，而mCherry 6HB和EGFP 8HB矩形在10-20 mM MgCl2下未检测到条带，表明DNA折纸方案不能直接移植到mRNA-DNA杂合物中。我们假设消除二价阳离子可以通过增强RNA稳定性来提高折叠产率。确实，在低至60 mM的NaCl浓度下组装的折纸，在其他相同的缓冲条件下表现出更强的结构条带。尽管低浓度MgCl2已被证明有助于mRNA-DNA折纸折叠，我们选择NaCl作为mRNA-DNA杂合折纸组装的标准阳离子，以消除二价阳离子促进RNA降解的可能性，同时因其更高的产率和更宽的有效范围。
随后进行的NaCl浓度筛选确定了折纸折叠的通用最佳范围。AGE条带强度分析表明，fLuc 6HB、fLuc 24HB、mCherry 6HB和EGFP 8HB矩形在60至140 mM NaCl之间具有稳健的产率。值得注意的是，低至60 mM的NaCl浓度即可支持折纸形成，而大多数mRNA-DNA杂合物的最佳折叠发生在110-120 mM。因此，我们采用115 mM NaCl作为标准组装条件。
支架与订书钉比例优化
接下来优化了支架与订书钉的摩尔比，预计理想比例会与DNA折纸不同，因为RNA-DNA双链体具有与DNA-DNA双链体不同的热力学稳定性。AGE分析显示，mCherry在1:2至1:7.5的比例之间产率最大，EGFP 8HB矩形也呈现相似趋势。值得注意的是，低至1:1.5的比例足以支持两种结构的折纸形成，这与RNA-DNA折纸所需订书钉过量远少于DNA折纸的报道一致。我们将这种更高的订书钉效率归因于RNA中更强的碱基堆积和2'-OH稳定作用。为了确保设计间的一致性，我们在后续实验中标准化使用了1:7.5的支架-订书钉比例。
退火方案优化
最后，我们评估了退火方案如何影响杂合折纸产率。热孵育驱动DNA折纸组装并防止动力学陷阱，但典型的退火程序可能与RNA-DNA杂合物不兼容，因为RNA更容易陷入动力学陷阱，并且在高温下更易发生自催化。温度过低可能无法破坏RNA二级结构从而降低产率，而温度过高则会降解RNA。我们首先测试了从mRNA-DNA折纸等温组装、生理条件下DNA折纸组装以及钠缓冲条件改编而来的4小时等温方案，并将其与标准温度梯度退火方案进行比较。具体而言，我们评估了EGFP 8HB矩形和EGFP 8HB圆柱体在4小时等温与4小时退火条件下的情况，以确定效应是否因2D与3D架构而异。AGE分析显示，在同一温度下，退火梯度方案 consistently 比等温方案产率更高。这些结果表明，55°C下的等温孵育可以组装mRNA-DNA杂合折纸，但在相同温度下的退火梯度能产生更优的产率。等温方案最高温度的进一步优化可能会提高效率并抑制动力学有利的副产物。
在确定最佳孵育方案后，我们接着确定了能实现最有效折叠的最高温度（Tmax）。我们对在不同Tmax值（每个都匹配相应的升温速率）和NaCl浓度下使用4小时退火方案组装的EGFP 8HB矩形折纸进行了全面筛选。AGE图像和相应的条带强度分析显示，在40至80°C的Tmax值和80至140 mM的NaCl浓度范围内，结构条带具有可比性。这些数据表明，40-80°C的温度范围结合60-140 mM NaCl足以支持mRNA-DNA杂合折纸的正确折叠。
值得注意的是，在所有测试的钠浓度下，Tmax为50-60°C时条带强度最为一致，表明存在一个普遍的最佳温度窗口。原子力显微镜（AFM）分析进一步证实了这些发现：在Tmax= 60°C下合成的EGFP 8HB矩形结构图像形状更均匀，且与在Tmax= 50或70°C下组装的结构相比，包含更少的部分折叠中间体。我们推断，高于70°C的温度可能会加速RNA自催化并阻碍折叠产率，而低于50°C的Tmax可能使RNA二级结构保持完整并减少订书钉的掺入。基于这些结果，我们采用55°C作为EGFP衍生的mRNA-DNA杂合折纸合成的标准Tmax，并将此条件推广到其他设计，以最大化结构完整性和产率。
为了进一步评估mRNA-DNA折纸在偏离上述最佳缓冲条件的、更具生物学相关性的条件下的结构稳定性，我们在补充了10%胎牛血清（FBS）的DMEM中对EGFP和mCherry结构进行了降解实验。AGE结果表明，所有测试折纸的结构条带在分钟级别 consistently 减少，而过量订书钉条带强度增加，表明折纸快速展开和降解，并凸显了在生物学应用中需要蛋白质或聚合物涂层进一步保护折纸结构的必要性。
AFM表征
为了进一步表征和验证mRNA-DNA杂合折纸的形成，我们对每个结构进行了原子力显微镜（AFM）成像。AFM重建图像显示，所有在我们标准条件下（115 mM NaCl；Tmax= 55°C，4小时退火）合成的折纸（除EGFP 8HB圆柱体外）均显示出单分散、折叠良好的结构，从而证实了这些合成参数的普遍适用性。对EGFP 8HB圆柱体的额外AFM成像显示了一致折叠良好的矩形折纸结构；然而，我们观察到完全闭合的管状和部分展开的管状物种的混合物，表明与云母表面和针尖诱导的展开有强相互作用，这与之前的报道一致。
更高分辨率的空气AFM重建显示了与设计预期一致的特征：大多数单个折纸显示出一个与AT尾对应的柔性延伸（仅EGFP 8HB矩形中缺失）和一个与螺旋束匹配的密集区域，进一步证实了正确折叠。
在确立与设计特征的定性相似性后，我们通过比较实验尺寸与理论预测来量化折纸的保真度。我们测量了RNA-DNA螺旋的轴向长度（x）和螺旋宽度（y）。除fLuc 24HB外，所有设计的平均轴向长度均落在严格A型和B型构象的估计值之间，这与RNA-DNA双链体采用介于A型和B型之间中间构象的报道一致。相比之下，除EGFP 8HB矩形外，所有结构的平均螺旋宽度均比估计值大2-3倍。我们将这种差异归因于空气AFM固有的成像伪影，包括针尖卷积效应。
为了验证AFM针尖效应，我们在相同条件下对类似的DNA 6HB对照进行了成像。该DNA 6HB的AFM重建图像反映了杂合折纸的趋势：测量的长度与估计值匹配，而测量的宽度则大了2-3倍。因此，我们得出结论，宽度差异反映了AFM成像偏差，而非结构完整性的缺乏。
结论与展望
本研究构建并系统研究了一系列具有不同尺寸、形状、订书钉交叉策略、堆积密度和基因编码支架的紧凑型mRNA-DNA杂合折纸纳米结构。通过剖析个体设计特征和合成条件的影响，我们建立了用于高产率组装杂合折纸的通用参数。在所有测试的设计中，我们发现非对称A型交叉、升高的单价阳离子浓度和中温退火方案 consistently 提高了折叠产率和结构保真度。这些改进可能反映了对RNA不稳定性的缓解、动力学陷阱的减少以及对RNA-DNA螺旋几何形状的明确适应。基于这些发现，我们提出了一个标准化的合成方案，可作为形成用于基因递送和其他应用的mRNA-DNA杂合折纸的起点。
虽然本研究为可靠的杂合折纸组装奠定了基础，但需要进一步的工作来完善合成、表征和原位性能。特别是在生物学相关条件下单个结构基序的稳定性及其对mRNA翻译效率的影响值得系统研究。此类研究对于充分释放杂合折纸在治疗和诊断应用方面的潜力至关重要。
尽管存在这些剩余的挑战，目前的工作建立了一个设计规则和合成条件的框架，使mRNA-DNA杂合折纸更具可预测性和可及性。利用该平台的高可编程性和多功能性，可能为精准医疗、基因递送和纳米治疗开辟新途径，加速杂合折纸从概念验证到实用生物医学工具的转化。
