绿色合成铜纳米颗粒：源自Ononis natrix提取物的高效抗菌及抗生物膜活性研究

《Medical Care》：Copper nanoparticles derived from the extract of Ononis natrix (L.): Characterization, antibacterial, and antibiofilm activities

本文首次报道了利用黄色芒刺豆（Ononis natrix）植物提取物绿色合成铜纳米颗粒（CuNPs），并系统评估了其对抗耐药海洋细菌的抗菌及抗生物膜活性。研究发现，该CuNPs具有显著的抗菌效果（MIC为0.0195-0.0781 mg/mL）和高效的抗生物膜能力（抑制率高达91.98%），且细胞毒性较低（LC50为977.23 μg/mL），为开发环境友好型防污剂提供了新策略。

　　

1. 引言

海洋生物污损是工业和环境领域面临的一大挑战，指微生物、藻类等生物在浸水表面附着和积累，增加了船舶航行阻力与燃料消耗，并可能导致入侵物种传播。纳米技术，特别是金属纳米颗粒，因其独特的物理化学性质，在生物医学和环境修复领域展现出广阔前景。其中，铜纳米颗粒（CuNPs）因其优异的光学、电学和催化性能而备受关注。然而，传统化学合成方法常使用有毒还原剂，增加了CuNPs的生物毒性。因此，开发绿色、可持续的合成方法至关重要。

植物提取物富含多酚、黄酮类等植物化学物，可作为理想的还原剂和封端剂，用于金属离子的还原和纳米颗粒的稳定。黄色芒刺豆（Ononis natrix，豆科）是一种广泛分布于摩洛哥西南部的野生植物，具有民族药用价值，但其在纳米材料合成中的应用尚未被探索。本研究旨在首次利用O. natrix乙醇提取物绿色合成CuNPs，并全面评估其抗菌、抗生物膜活性及细胞毒性，为开发新型天然防污剂提供科学依据。

2. 材料与方法

• •
  2.1. 植物材料与提取物制备：植物地上部分采集自摩洛哥Imi N’tanout地区，清洗、阴干、研磨后，用80%乙醇浸提48小时，过滤得到提取物。
• •
  2.2. 总多酚与总黄酮测定：分别采用Folin-Ciocalteu法和氯化铝比色法测定，结果以没食子酸当量（mg GAE/g DM）和芦丁当量（mg RE/g DM）表示。
• •
  2.3. CuNPs的合成：将0.1 M硫酸铜溶液与植物提取液混合，调节pH至7.0，于60°C反应60分钟。反应液离心收集沉淀，40°C干燥得到深绿色CuNPs粉末。
• •
  2.4. 表征方法：
  • •
    紫外-可见光谱（UV-Vis）：检测200-800 nm范围内的吸收光谱。
  • •
    傅里叶变换红外光谱（FTIR）：分析400-4000 cm^-1范围内的官能团。
  • •
    X射线衍射（XRD）：确定晶体结构，并通过Scherrer方程计算晶粒尺寸。
  • •
    扫描电子显微镜与能量色散X射线光谱（SEM-EDX）：观察形貌、尺寸分布及元素组成。
• •
  2.5. 丰年虾细胞毒性实验：测定CuNPs和植物提取物对丰年虾（Artemia salina）幼虫的半数致死浓度（LC₅₀）。
• •
  2.6. 抗菌活性：采用微量稀释法测定CuNPs对8种耐药海洋细菌（包括革兰氏阳性和阴性菌）的最低抑菌浓度（MIC）。
• •
  2.7. 抗粘附与抗生物膜活性：通过结晶紫（CV）染色法定量评估CuNPs在亚抑菌浓度下对细菌初始粘附和成熟生物膜形成的抑制作用。
• •
  2.8. SEM观察生物膜：通过SEM直观对比经CuNPs处理与未处理的表面细菌生物膜形态变化。

3. 结果

• •
  3.1. 植物化学分析：O. natrix乙醇提取物中总多酚含量为52.14 ± 8.32 mg GAE/g DM，总黄酮含量为17.3 ± 1.91 mg RE/g DM。
• •
  3.2. UV-Vis分析：合成过程中溶液颜色由蓝变绿，并在408 nm处出现特征吸收峰，证实了CuNPs的形成。
• •
  3.3. FTIR分析：光谱显示CuNPs存在多个特征官能团吸收峰（如1597 cm^-1处的N-H弯曲，1714 cm^-1处的C=O伸缩等），表明植物提取物中的生物活性成分成功包覆在CuNPs表面。
• •
  3.4. XRD分析：衍射峰对应立方晶系结构（空间群Pn-3m），平均晶粒尺寸为27.6 nm。
• •
  3.5. SEM-EDX分析：CuNPs呈近似球形，尺寸分布主要在50-60 nm之间。EDX证实铜元素（以氧化铜形式）占总质量的74.6%。
• •
  3.6. 细胞毒性：CuNPs对丰年虾的LC₅₀为977.23 μg/mL，属于低毒；而O. natrix提取物的LC₅₀为1445.6 μg/mL，基本无毒。两者毒性均远低于硫酸铜对照（LC₅₀= 25 μg/mL）。
• •
  3.7. 抗菌活性：CuNPs对所测试的耐药海洋细菌均表现出抗菌活性。其中，对Shewanella algae、Staphylococcus pasteuri、S. aureus和Pseudomonas stutzeri的MIC最低，为0.0195 mg/mL；对Enterobacter hormaechei的MIC为0.0781 mg/mL。
• •
  3.8. 抗粘附与抗生物膜活性：CuNPs在亚抑菌浓度下表现出强大的抗粘附（抑制率最高达91.98%）和抗生物膜（抑制率最高达86.70%）能力。不同菌株间的抑制效果存在差异。
• •
  3.9. SEM观察：与未处理组相比，经CuNPs处理的表面细菌生物膜形成受到显著抑制，细菌形态发生明显改变，细胞间粘附丧失，并可见胞外多糖沉积物，表明生物膜结构被破坏。

4. 讨论

本研究成功利用O. natrix提取物合成了CuNPs，其多酚和黄酮含量与已有报道相符。UV-Vis光谱的特征峰、FTIR的官能团信息、XRD的晶体结构以及SEM-EDX的形貌与元素组成，均充分证实了CuNPs的成功合成与稳定性。

与其它绿色合成方法相比，本研究得到的CuNPs具有更强的抗菌活性（更低的MIC值），这可能得益于O. natrix提取物中多酚类化合物与CuNPs的协同作用。这些酚类物质不仅作为还原剂和封端剂，还可能增强了纳米颗粒与细菌细胞的相互作用。CuNPs的抗菌机制可能涉及释放Cu²⁺离子、产生活性氧（ROS）、破坏细胞膜完整性以及干扰遗传物质。

在抗生物膜方面，CuNPs展现了卓越的性能，不仅能有效防止细菌初始粘附，还能破坏已形成的成熟生物膜结构。SEM结果直观地揭示了CuNPs处理后细菌形态的严重损伤和生物膜基质的瓦解。其抗生物膜活性可能源于对细菌粘附分子、胞外聚合物（EPS）分泌以及群体感应（QS）系统的多重干扰。

值得注意的是，本研究合成的CuNPs在表现出高效抗菌抗生物膜活性的同时，对丰年虾模型的细胞毒性相对较低。这种较高的生物安全性与其较大的颗粒尺寸（50-60 nm）可能有关，因为更小的纳米颗粒通常具有更高的细胞渗透性和毒性。

5. 结论

本研究首次利用黄色芒刺豆（Ononis natrix）提取物绿色合成了铜纳米颗粒（CuNPs）。该CuNPs具有显著的抗菌活性，尤其对抗药性海洋细菌有效，并能高效抑制细菌粘附和生物膜形成。同时，其细胞毒性较低，展现出良好的生物安全性。这些特性使其成为一种极具潜力的环境友好型防污剂候选材料，可用于船舶防污涂层等领域，以减少传统化学杀菌剂的环境危害。然而，本研究主要针对阿加迪尔湾的特定菌株，未来需在更广泛的微生物种类和环境中验证其效能，并深入探究其分子作用机制及长期环境行为，以推动其实际应用。