基于Ononis natrix植物提取物绿色合成的铜纳米颗粒：表征及其对海洋耐药菌的抗菌和抗生物膜活性

《Medical Care》：Copper nanoparticles derived from the extract of Ononis natrix (L.): Characterization, antibacterial, and antibiofilm activities

本研究首次报道了利用植物Ononis natrix提取物绿色合成铜纳米颗粒（CuNPs），并系统评估了其表征、低细胞毒性、以及对多重耐药海洋细菌显著的抗菌和抗生物膜活性，为开发新型、高效、低毒的环保型防污剂提供了有前景的策略。

　　

1. 引言

海洋生物污损，即细菌、藻类、藤壶等生物在水下固体表面的附着与积累，是困扰工业和航运领域的重大问题。它会导致船舶表面粗糙度增加，航行性能下降，燃料消耗和污染物排放增多，并可能通过船只传播入侵物种，破坏当地生态系统。为了应对这一挑战，开发高效、环保的防污剂至关重要。

纳米技术，特别是金属纳米颗粒，因其独特的物理化学性质在生物医学和环境修复领域展现出巨大潜力。其中，铜纳米颗粒（CuNPs）因其显著的光学、电学、催化及传感特性而备受关注。然而，传统的化学合成方法常使用有毒的还原剂，可能加剧CuNPs对生物体的毒性。“绿色合成”方法利用植物提取物中的生物活性成分作为还原剂和稳定剂，提供了一种更安全、可持续的替代方案。

黄色芒柄花（Ononis natrix，豆科）是一种广泛分布于摩洛哥西南部的野生植物，尽管在民族医学中有应用记载，但其药理潜力，尤其是在纳米颗粒合成方面的应用，尚未得到充分探索。本研究旨在首次利用O. natrix叶片提取物绿色合成CuNPs，并全面评估其表征、细胞毒性、抗菌及抗生物膜活性，以期为开发天然、有效且环境友好的防污剂提供科学依据。

2. 材料与方法

2.1. 植物提取物制备与植物化学分析

从摩洛哥伊米恩塔努特地区采集O. natrix地上部分，清洗、阴干、研磨成粉后，用80%乙醇浸提48小时，过滤得到提取物。采用Folin-Ciocalteu法测定总多酚含量（以没食子酸当量表示，GAE），采用氯化铝法测定总黄酮含量（以芦丁当量表示，RE）。

2.2. CuNPs的绿色合成

将0.1 M硫酸铜（CuSO₄）溶液与植物提取物混合，用氢氧化钠（NaOH）调节pH至7.0，于60°C反应60分钟。反应液颜色由蓝变绿，表明纳米颗粒形成。随后通过离心收集沉淀，干燥后得到深绿色CuNPs粉末。

2.3. CuNPs的表征方法

采用多种技术对合成的CuNPs进行表征：

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  紫外-可见光谱（UV-Vis）：在200-800 nm波长范围内扫描，确认纳米颗粒的形成。
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  傅里叶变换红外光谱（FTIR）：在400-4000 cm^-1范围内分析，鉴定提取物和CuNPs中的官能团。
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  X射线衍射（XRD）：分析CuNPs的晶体结构和平均晶粒尺寸，使用Scherrer公式计算。
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  扫描电子显微镜与能谱分析（SEM-EDX）：观察CuNPs的形貌、尺寸分布并进行元素组成分析。

2.4. 生物活性评估

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  细胞毒性试验：使用卤虫（Artemia salina）无节幼体进行致死性生物测定，计算半数致死浓度（LC₅₀），评估CuNPs和植物提取物的毒性。
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  抗菌活性：采用微量肉汤稀释法，测定CuNPs对8种从摩洛哥阿加迪尔海岸分离的、对多种抗生素和重金属具有耐药性的海洋细菌的最低抑菌浓度（MIC）。测试菌株包括：蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）、巴氏葡萄球菌（Staphylococcus pasteuri）、金黄色葡萄球菌（S. aureus ATCC 29213）、海单胞菌属（Marinomonas sp.）、霍氏肠杆菌（Enterobacter hormaechei）、施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）、藻类希瓦氏菌（Shewanella algae）和嗜冷杆菌属（Psychrobacter sp.）。
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  抗粘附与抗生物膜活性：通过结晶紫（CV）染色法，定量评估CuNPs在亚抑菌浓度下对细菌初始粘附和24小时成熟生物膜形成的抑制率。并使用SEM直观观察经CuNPs处理后，细菌在铝片表面生物膜形态的变化。

3. 结果

3.1. 植物化学分析与CuNPs表征

O. natrix乙醇提取物中总多酚和总黄酮含量分别为52.14 ± 8.32 mg GAE/g DM和17.3 ± 1.91 mg RE/g DM。UV-Vis光谱显示在408 nm处有一个明显的特征吸收峰，证实了CuNPs的形成。FTIR分析揭示了提取物和CuNPs中存在羟基（-OH）、胺基（N-H）、羰基（C=O）等官能团，这些酚类和黄酮类化合物在还原和稳定纳米颗粒中发挥了关键作用。XRD图谱表明合成的CuNPs为立方晶系，平均晶粒尺寸为27.6 nm。SEM显示CuNPs呈近似球形，尺寸分布在50-60 nm之间；EDX证实其主要成分为氧化铜（CuO），占总质量的74.6%。

3.2. 细胞毒性低

卤虫致死试验表明，O. natrix提取物和CuNPs的LC₅₀值分别为1445.6 μg/mL和977.23 μg/mL。根据毒性分类标准，提取物属于“无毒”，而CuNPs属于“低毒”，其毒性显著低于阳性对照硫酸铜（CuSO₄， LC₅₀= 25 μg/mL）。这表明绿色合成的CuNPs具有较好的生物安全性。

3.3. 显著的抗菌活性

CuNPs对所有测试的耐药海洋细菌均表现出抗菌活性。对霍氏肠杆菌（E. hormaechei）的MIC为0.0781 mg/mL，对蜡样芽孢杆菌（B. cereus）、海单胞菌属（Marinomonas sp.）和嗜冷杆菌属（Psychrobacter sp.）的MIC为0.039 mg/mL，而对藻类希瓦氏菌（S. algae）、巴氏葡萄球菌（S. pasteuri）、金黄色葡萄球菌（S. aureus）和施氏假单胞菌（P. stutzeri）的抗菌活性最强，MIC低至0.0195 mg/mL。

3.4. 高效的抗粘附与抗生物膜活性

CuNPs在亚抑菌浓度下能有效抑制细菌粘附和生物膜形成。抗粘附抑制率从49.48%（S. algae）到91.98%（E. hormaechei）不等。抗生物膜抑制率从24.01%（S. algae）到86.70%（S. pasteuri）不等。SEM观察直观地证实了CuNPs的处理能显著抑制生物膜的形成，导致细菌细胞形态发生明显改变，细胞间粘附丧失，并可见生物膜基质（胞外多糖）的破坏。

4. 讨论

本研究成功利用O. natrix提取物合成了球形、低毒的CuNPs。提取物中丰富的多酚和黄酮类物质既作为还原剂，也作为封端剂，确保了纳米颗粒的稳定性和生物相容性。所合成的CuNPs对多种耐药海洋细菌，包括革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，均表现出强效的抗菌活性，其MIC值优于许多先前报道的结果。这可能是由于CuNPs与植物多酚的协同抗菌效应。

其抗菌机制可能涉及多个方面：释放的铜离子（Cu²⁺）诱导产生活性氧物种（ROS），破坏细菌细胞膜完整性，干扰细胞代谢并损伤遗传物质；同时，纳米颗粒本身与细菌表面的静电相互作用也可能促进其杀菌效果。在抗生物膜方面，CuNPs不仅能抑制细菌的初始表面粘附，还能破坏已形成的生物膜三维结构，这通过降低细菌粘附、干扰生物膜基质分泌以及直接作用于浮游细菌相等多种途径实现。

5. 结论

本研究首次证实了利用O. natrix植物提取物绿色合成CuNPs的可行性。所制备的CuNPs具有结晶度良好、尺寸均一、细胞毒性低的特点，并对多重耐药的海洋细菌展现出卓越的抗菌和抗生物膜功效。这些特性使其成为一种极具潜力的环保型防污剂候选材料，可用于防治船舶生物污损。该研究不仅拓展了植物资源在纳米生物技术中的应用，也为解决抗生素耐药性和生物膜相关挑战提供了新的思路。未来研究可进一步探索其在不同海洋环境中的广谱抗菌性、长期稳定性、作用分子机制以及在实际应用中的安全性。