《Journal of Biomedical Science》：Genetic variation and mutational determinants of azole resistance in Candida albicans strains of oropharyngeal colonization in HIV patients and bloodstream infections
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本研究深入比较分析了来自重症监护室（ICU）念珠菌血流感染（BSI）患者和HIV感染口咽定植患者的唑类药物耐药白念珠菌（Candida albicans）菌株。通过全基因组测序（牛津纳米孔平台）和多维度分析，揭示了ERG11结构突变是耐药的基础，而HIV患者菌株表现出的更高耐药性（氟康唑MIC50>256 mg/L）则与独特的CDR1/CDR2错义突变及ERG11启动子变异（如Hap43p/Hap5p位点缺失）相关，突出了转录调控与多基因协同作用在超高水平耐药中的关键机制。
材料与方法
本研究共鉴定并分析了27株唑类耐药的白念珠菌临床分离株，其中16株来自HIV感染者的口咽定植菌，11株（5株成人ICU，6株儿科ICU）来自念珠菌血流感染（BSI）患者。从中选取了7株具有代表性（3株HIV患者，2株成人ICU，2株儿科ICU）的菌株进行深入的核心基因组分析。通过牛津纳米孔（Oxford Nanopore）平台进行全基因组测序，辅以短读长测序进行纠错和验证。采用Flye软件进行从头组装。研究分析了与唑类耐药相关的多个基因，包括靶点基因ERG11、外排泵基因CDR1、CDR2和MDR1，以及调控基因UPC2、TAC1、NDT80和MRR1。通过Ka/Ks（非同义替换率/同义替换率）比值分析ERG11基因是否受到正向选择压力。使用外排泵抑制剂米尔贝霉素（milbemycin oxime）评估外排泵功能，通过测量其存在时唑类药物最小抑菌浓度（MIC）的降低倍数来证实外排泵的参与。利用PathoYeastrac工具分析ERG11基因上游1000个碱基对区域的转录因子结合位点变异。
全基因组序列与相似性分析
使用平均核苷酸一致性（ANI）和MASH距离两种方法对7株白念珠菌分离株和参考菌株进行基因组相似性分析。结果显示，来自HIV患者的三株菌株（#5–19， #5–72， #9–793）与来自成人ICU患者的一株菌株（#C34）形成了一个独特的基因组簇，其ANI差异≤0.13%，MASH距离<0.005，表明它们具有近乎相同的基因组结构。其余菌株则形成了另一个聚类。这一聚类模式提示了HIV患者菌株间可能存在流行病学联系或保守的基因组特征。
系统发育分析
研究采用两种方法构建系统发育树：一是基于BUSCO鉴定的单拷贝直系同源基因的氨基酸序列（以酿酒酵母S288C为外群），二是基于多位点序列分型（MLST）数据。两种方法的结果一致。全基因组单拷贝直系同源基因分析显示，HIV菌株#9–793和#5–19紧密聚类，而BSI菌株（#G01， #12–12， #2–31）则形成另一个组。MLST分析进一步支持了这一结果，将#9–793和#5–19归入MLST进化枝16附近，而#G01， #12–12， #2–31则属于进化枝1。该结果与全基因组比较的发现相符。
唑类药物耐药相关的关键遗传变异
在所有唑类耐药菌株中均检测到了ERG11的错义突变，这支持了ERG11突变在耐药中的核心作用。然而，HIV患者菌株（氟康唑MICs >256 mg/L）的耐药水平显著高于ICU患者菌株（氟康唑MICs 16–64 mg/L），提示存在额外的耐药机制。ERG11编码区分析并未发现正向选择的证据（所有菌株的Ka/Ks比值均<1.0），且未发现HIV患者菌株特有的ERG11突变。
研究在所有分析的耐药相关基因（ERG11， CDR1， CDR2， MDR1， UPC2， TAC1， NDT80， MRR1）中都发现了错义突变。值得注意的是，仅在HIV患者的菌株中发现了CDR1和CDR2基因独有的错义突变，这些突变位于Cdr1p蛋白的第842位（S/S）和Cdr2p蛋白的第121位（V/I）、1069位（R/R或K/R）和1337位（F/F）。相比之下，在MDR1基因中未发现显著的结构性改变。
外排泵功能验证
通过使用ABC转运蛋白抑制剂米尔贝霉素（milbemycin oxime）来评估外排泵对耐药性的贡献。结果显示，加入米尔贝霉素后，所有菌株对氟康唑和伏立康唑的MIC值均显著降低，证实了外排泵（尤其是Cdr1p/Cdr2p）的参与。然而，HIV患者菌株的MIC降低幅度（例如，菌株#5–19和#9–793的降低幅度为25–50%）远小于ICU患者菌株（降低幅度可达98%）。这表明HIV患者菌株的极端耐药并非完全依赖于可被抑制剂逆转的基础外排泵活性，而是可能存在其他机制协同作用。
ERG11启动子区域分析
对ERG11基因上游1000 bp启动子区域的分析揭示了一个重要发现：与ICU患者菌株相比，HIV患者菌株的ERG11启动子中Hap43p/Hap5p（即CCAAT盒结合复合物，CBC）的转录因子结合位点存在显著缺失。尽管CBC在调控白念珠菌唑类药物耐药性方面的具体作用尚未完全阐明，但在烟曲霉中，CBC通过抑制甾醇感应因子SrbA的表达来调节唑类药物敏感性。本研究中HIV菌株ERG11启动子CBC位点的缺失，可能导致了ERG11转录调控的异常，从而促进了更高水平的耐药性。启动子区域还观察到Wor3p和Mrr1p结合位点的其他变异。
讨论与结论
本研究证实，ERG11结构突变是导致ICU和HIV患者白念珠菌临床分离株产生唑类药物耐药性的基础分子机制。对于HIV患者口咽定植菌株表现出的更高水平耐药性，研究将其归因于特异性CDR1/CDR2错义突变以及独特的ERG11启动子变异的共同作用。
系统发育和基因组相似性分析表明，所选菌株分布在不同的进化枝，具有良好的代表性，其中HIV患者菌株与部分ICU菌株存在紧密的基因组关联。
Ka/Ks比值分析未发现ERG11基因受到正向选择的证据，说明这些突变可能是在长期抗真菌药物选择压力下逐渐积累，而非受到强烈的定向选择。
外排泵抑制剂实验证明了ABC外排泵（Cdr1p/Cdr2p）在耐药中的重要作用，但HIV菌株较小的MIC降幅提示其耐药表型更依赖于基因突变积累所优化的、难以被外部抑制剂完全逆转的转录输出调控。
启动子分析发现的CBC结合位点缺失，为HIV患者菌株ERG11基因表达的异常调控提供了潜在的分子解释，这可能与慢性定植生态位中的独特选择压力有关。
综上所述，本研究阐明了白念珠菌唑类高水平耐药的复杂基因组基础。HIV患者菌株的耐药性是由ERG11结构突变、特定的外排泵（CDR1/CDR2）突变以及ERG11启动子调控变异（特别是CBC位点缺失）协同作用的结果。这些发现为开发针对高耐药菌株的分子诊断标志物（如特定的启动子变异和外排泵突变）和联合治疗策略（如唑类药物联合外排泵抑制剂）提供了重要的理论基础和潜在的转化应用方向。
