《International Journal of Psychophysiology》：Sleep-like slow waves in ADHD: Regional specificity in combined type
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生殖器疱疹（GH）主要由HSV-2引起，MYR黄酮类化合物通过稳定结合gD蛋白展现体外抗病毒活性，但存在水溶性低和代谢不稳定问题。本研究将MYR负载于聚羧酸类纳米颗粒（PVAP、HPMCP、Eudragit S100），证实纳米载体能保持MYR活性并提高稳定性（≥4周），其中PVAP-MYR纳米颗粒通过in-situ凝胶制剂实现阴道递送，在小鼠模型中疗效优于纯MYR溶液。
苏迪普塔·马尔利克（Sudipta Mallick）| 潘卡杰·夏尔马（Pankaj Sharma）| 特贾比拉姆·亚达瓦利（Tejabhiram Yadavalli）| 拉姆·科甘蒂（Ram Koganti）| 苏丹舒·库马尔·辛格（Sudhanshu Kumar Singh）| 凯莉·吉村（Kailee Yoshimura）| 迪维亚·卡普尔（Divya Kapoor）| 约格什·苏塔尔（Yogesh Sutar）| 约瑟夫·亚当斯（Joseph Adams）| 曼朱莎·安纳吉（Manjusha Annaji）| 迪帕克·舒克拉（Deepak Shukla）| 阿比吉特·A·戴特（Abhijit A. Date）
夏威夷大学希洛分校丹尼尔·K·井上药学院（The Daniel K. Inouye College of Pharmacy, University of Hawaii Hilo），希洛，HI 96720，美国
摘要
生殖器疱疹（Genital Herpes, GH）是一种主要由单纯疱疹病毒2型（HSV-2）引起的持续性性传播感染。最近研究表明，天然黄酮类化合物没食子素（Myricetin, MYR）具有较低的溶解度，但能够靶向HSV的gD蛋白。通过计算工具分析，我们发现MYR能与HSV gD蛋白形成稳定的复合物。MYR对HeLa细胞具有较好的耐受性（CC50约为2.5 mM），并在体外实验中显示出对抗野生型HSV-2的抗病毒活性。然而，MYR的低水溶性和可能的代谢失活限制了其递送效果。为克服这些挑战，我们将MYR封装到药用聚羧酸聚合物（如聚醋酸乙烯酯邻苯二甲酸酯PVAP、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯HPMCP和Eudragit S100）制备的纳米颗粒（NPs）中，这些MYR-聚羧酸纳米颗粒（粒径≤100 nm）在至少4周内保持了较高的胶体稳定性和化学稳定性。MYR-聚羧酸纳米颗粒在体外实验中仍保留了其原有的抗氧化活性，其中MYR-PVAP纳米颗粒的抗病毒活性最强。我们开发了一种原位凝胶制剂，含有MYR-PVAP纳米颗粒，用于促进其阴道递送，在生殖器疱疹的小鼠模型中，该制剂比纯MYR溶液表现出更好的疗效。
引言
生殖器疱疹（Genital Herpes, GH）是一种全球范围内普遍存在的性传播感染（Sexually Transmitted Infection, STI），影响着近5亿人（Jaishankar和Shukla，2016年）。该病主要由单纯疱疹病毒2型（HSV-2）引起，会导致反复出现的疼痛性生殖器病变，进而引发性功能障碍和心理社会问题，尤其是对女性而言（Borase和Shukla，2023年）。流行病学研究表明，HSV-2感染者感染和传播HIV-1的风险是普通人的2至3倍（Barnabas等人，2011年）。目前尚无疫苗可用于预防GH，也尚未找到根治方法，仅有的三种抗病毒药物——阿昔洛韦（Acyclovir）、伐昔洛韦（Valacyclovir）和泛昔洛韦（Famciclovir）——用于治疗原发性和复发性生殖器疱疹（Roett等人，2012年；Hollier和Eppes，2015年）。然而，这些药物无法完全阻止HSV-2的性传播。此外，耐药病毒株的出现进一步削弱了现有的治疗手段（Schalkwijk等人，2022年）。因此，迫切需要新的治疗GH的方法。
天然多酚类化合物在预防和/或治疗性传播病毒感染（包括GH）方面显示出潜力（Date和Destache，2016年）。没食子素（Myricetin, MYR）是一种天然存在于蔬菜、水果、坚果和浆果中的多酚，具有抗氧化、抗炎、抗癌、抗血栓、保护心脏和抗菌等多种活性（Wang等人，2019年；Carevic等人，2023年；Trivedi等人，2024年）。近年来多项研究证实了MYR对多种病毒（包括HPV、HIV-1和HSV）的抑制作用（Yuan等人，2016年；Zou等人，2020年；Sang等人，2021年；Dang等人，2022年；Fredsgaard等人，2023年）。最近的研究表明，MYR通过与病毒gD蛋白的直接相互作用来抑制其结合和侵入，对HSV-1和HSV-2均有效（Li等人，2020年）。但由于MYR的水溶性差、渗透性低以及口服生物利用度低，仅通过全身给药才能对其发挥抗病毒效果（Li等人，2020年）。目前尚无研究证实MYR在体内对局部（阴道）预防和/或治疗性传播病毒感染的有效性。尽管之前的研究证实了MYR对HSV-1/HSV-2的治疗潜力，但其水溶性和渗透性的限制使得需要开发合适的递送系统以实现更好的阴道递送，从而改善GH的预防和/或治疗效果。
我们之前发现，药用级别的pH敏感聚羧酸聚合物（如醋酸纤维素邻苯二甲酸酯）可以封装抗逆转录病毒药物，用于HIV感染的局部暴露前预防（Dezzutti等人，2004年；Shibata等人，2015年）。最近的研究还表明，药用级别的不可生物降解的甲基丙烯酸或邻苯二甲酸共聚物及其纳米颗粒（粒径约100 nm）在体外实验中对HSV感染具有预防和/或治疗作用，并能增强抗病毒药物的疗效（Yadavalli等人，2020年）。由于这些聚羧酸纳米颗粒含有羧酸基团，使其适用于阴道递送。然而，它们封装天然黄酮类化合物（如MYR）以实现其阴道递送的能力尚未得到评估。
本文首先证实了MYR对野生型HSV-2的有效性，并证明了药用级别的聚羧酸聚合物（Eudragit S100、HPMCP-55S和聚醋酸乙烯酯邻苯二甲酸酯PVAP）能够稳定封装MYR，形成的MYR-聚羧酸纳米颗粒在至少1个月内保持胶体稳定性和化学稳定性，同时其抗氧化和抗病毒活性在体外实验中未发生改变。进一步研究显示，聚醋酸乙烯酯邻苯二甲酸酯（PVAP）-MYR纳米颗粒可有效结合Poloxamer 407制成原位凝胶制剂。最后，在生殖器疱疹的小鼠模型中，含有PVAP-MYR纳米颗粒的原位凝胶制剂显示出比纯MYR更高的抗病毒效果。因此，这种原位凝胶制剂可能有助于治疗GH等性传播感染。
材料
Eudragit? S100（分子量：135,000 Da，Evonik Corporation，美国加利福尼亚州洛杉矶）、聚醋酸乙烯酯邻苯二甲酸酯（Phthalavin?，分子量：约61,000 Da，Colorcon, Inc，美国宾夕法尼亚州哈利斯维尔）、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯（HPMCP55S，分子量：60,200 Da，Shin-Etsu Chemical Co. Ltd，日本东京）和Poloxamer 407（Kolliphor? P407；BASF Corporation，美国新泽西州弗洛勒姆帕克）作为赠品提供。丙酮（AR级）和二甲基亚砜（DMSO）从商业渠道购买。
分子动力学模拟显示MYR可稳定结合HSV gD蛋白
使用Discovery Studio 2021软件（图1）观察了MYR与其已识别的病毒靶标gD蛋白之间的相互作用。gD和MYR复合物的结合能为?7.9 kcal/mol。为了验证对接复合物的稳定性，对仅含gD和gD-MYR复合物进行了50 ns的分子动力学（MD）模拟，并计算了模拟过程中的主链均方根偏差（RMSD）。
讨论
生殖器疱疹（GH）是一种主要由单纯疱疹病毒2型（HSV-2）引起的常见性传播感染（Johnston等人，2022年）。该病以持续性和终身感染为特征，并伴有周期性复发。目前推荐使用高剂量阿昔洛韦（ACV）、伐昔洛韦或泛昔洛韦进行口服治疗（Roett等人，2012年；Hollier和Eppes，2015年）。然而，临床试验表明现有的GH治疗方法无法完全根除病毒。
结论
像MYR这样的天然黄酮类化合物可能是治疗HSV-2感染的便捷且成本较低的选择。药用级别的聚羧酸聚合物能够稳定封装天然黄酮类化合物（如MYR），并在阴道给药时发挥协同抗病毒作用。据我们所知，这是首次报道纳米级天然黄酮用于阴道GH治疗的案例。然而，需要每日多次给药才能达到理想效果。
作者贡献声明
苏迪普塔·马尔利克（Sudipta Mallick）：负责撰写、审稿与编辑、原始稿件撰写、软件应用、方法设计、实验设计、数据分析与整理。
潘卡杰·夏尔马（Pankaj Sharma）：负责撰写、审稿与编辑、原始稿件撰写、数据可视化、软件应用、方法设计、实验设计、数据分析与整理。
负责撰写、审稿与编辑、原始稿件撰写、数据可视化、软件应用、项目管理、方法设计、实验设计、数据分析与整理。
利益冲突声明
作者声明不存在可能影响本文研究的已知财务利益或个人关系。
致谢
作者感谢Evonik USA、BASF USA、Shin-Etsu USA和Coloron USA提供用于研究的多种聚合物辅料样品。感谢Manjusha Annaji重复验证没食子素封装效率的相关实验。Abhijit A. Date和Deepak Shukla感谢NIH资助项目R24EY033598的支持。Abhijit A. Date还感谢R01EY036247、R21AI176907、R21AI184072以及R.K.药学院的资助。
