《Journal of Advanced Research》：A novel mechanism of selenium deficiency driving aberrant Th17 cell differentiation via GPX3-targeted PIG3: mitophagy blockade exacerbates mtDNA release
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本研究揭示了硒缺乏如何通过GPX3/PIG3信号轴驱动异常Th17细胞分化的新机制。研究人员发现，硒缺乏会下调GPX3，抑制PIG3，导致细胞内氧化还原失衡和线粒体功能障碍，进而阻断线粒体自噬流并加剧线粒体DNA（mtDNA）泄漏，最终促进Th17细胞异常分化。该发现为理解硒在免疫调节中的作用及治疗Th17相关的自身免疫病提供了潜在新靶点。
在免疫系统复杂的交响曲中，辅助性T细胞17（Th17细胞）扮演着亦正亦邪的角色。它们本是抵御细胞外病原体的忠诚卫士，但一旦失控，又会“倒戈相向”，成为推动类风湿性关节炎、多发性硬化症等一系列自身免疫性疾病发生发展的“元凶”之一。是什么在幕后操纵着Th17细胞的命运，让其从保护者变为破坏者？近年来，微量元素硒（Selenium, Se）因其对免疫稳态的关键作用而备受关注。硒在体内主要通过硒蛋白发挥功能，其中，谷胱甘肽过氧化物酶3（Glutathione Peroxidase 3， GPX3）是唯一分泌型的抗氧化酶。已知硒缺乏会损害免疫器官（如脾脏）的功能，并与自身免疫病风险增加相关，但硒缺乏是否以及如何通过GPX3来影响Th17细胞的分化，其背后的分子机制却如一团迷雾，亟待揭开。
为了回答这一系列问题，由东北农业大学动物医学院徐世文教授团队领导的研究小组，在《Journal of Advanced Research》上发表了一项开创性研究。他们巧妙地利用在体和离体实验相结合的策略，首次描绘出一条从“营养缺乏”到“免疫失衡”的清晰路径：硒缺乏通过下调GPX3，进而抑制其下游靶点p53诱导基因3（p53-inducible gene 3, PIG3），引发细胞内“烽烟四起”（氧化应激）和“能量工厂”故障（线粒体功能障碍），最终导致“细胞垃圾清理系统”（线粒体自噬）瘫痪，使得受损的线粒体遗传物质（mtDNA）大量泄漏，从而“点燃”了异常Th17细胞分化的导火索。这一发现不仅为理解硒的免疫调节功能提供了全新视角，也为干预硒缺乏相关免疫紊乱及Th17介导的自身免疫病指明了潜在的干预靶点。
研究人员为开展这项研究，综合运用了多种关键的技术方法。他们首先建立了膳食硒缺乏的猪脾脏体内模型以及体外培养的猪脾淋巴细胞硒缺乏模型，作为研究基础。在分子机制探索上，他们采用了分子对接和免疫共沉淀（Co-IP）技术，验证了GPX3与PIG3之间的直接相互作用。为了评估细胞状态，研究团队系统检测了氧化应激指标（如活性氧ROS、过氧化氢H2O2、抗氧化酶活性）、线粒体功能（ATP含量、ATP酶活性、线粒体复合物蛋白表达）和线粒体动力学（融合/分裂相关基因表达）。通过透射电子显微镜（TEM）观察了线粒体超微结构的变化。利用mCherry-GFP-LC3B双标腺病毒感染技术，直观追踪了线粒体自噬流（mitophagic flux）的完整性。此外，他们还通过PicoGreen染色和激光共聚焦成像，检测了mtDNA的胞质泄漏情况，并通过定量实时PCR（qRT-PCR）和蛋白质印迹（Western blot, WB）分析了Th17细胞标志物、线粒体自噬相关蛋白以及cGAS-STING信号通路关键分子的表达变化。
分析硒缺乏猪脾脏的RNA测序结果
研究人员首先成功构建了硒缺乏猪模型，并通过RNA测序（RNA-seq）分析发现，与对照组相比，硒缺乏组脾脏中有1521个基因表达发生显著变化。基因富集分析显示，这些差异表达基因显著富集于免疫反应、IL-17信号通路等与Th17细胞分化密切相关的通路。在众多硒蛋白中，GPX3的表达变化最为显著，提示它可能是硒缺乏影响免疫的关键分子。
硒缺乏通过GPX3诱导异常的Th17细胞分化
体内外实验一致证实，硒缺乏或特异性敲低GPX3，均能显著促进猪脾淋巴细胞向Th17方向异常分化。具体表现为Th17细胞特征性细胞因子IL-17A及其受体IL-23R、关键转录因子RORγt和趋化因子受体CCR6的表达水平显著上调，而Th1和Th2型细胞因子的表达受到抑制。
硒缺乏通过降低GPX3活性来下调PIG3蛋白表达
深入机制研究发现，硒缺乏在脾脏组织中降低了GPX3的蛋白水平（尽管其mRNA有所上升），并显著下调了PIG3的mRNA和蛋白表达。在细胞实验中，敲低GPX3同样降低了PIG3的表达。通过分子对接预测和免疫共沉淀实验，研究人员证实了GPX3与PIG3蛋白之间存在直接的相互作用。而过表达PIG3可以逆转由GPX3敲低引起的PIG3表达下降。这些结果确立了GPX3对PIG3的靶向调控关系。
硒缺乏通过GPX3靶向PIG3降低抗氧化能力并诱导线粒体功能障碍
硒缺乏或GPX3敲低导致了严重的氧化应激，表现为活性氧（ROS）、4-羟基壬烯醛（4-HNE）和过氧化氢（H2O2）水平升高，而抗氧化酶（如过氧化氢酶CAT、谷胱甘肽过氧化物酶GSH-Px）活性和总抗氧化能力（T-AOC）下降。同时，线粒体功能受损，ATP合成减少，电子传递链（ETC）关键复合物亚基（如NDUFB8， SDHB， UQCRC2， MTCO1， ATP5A1）的表达下调。重要的是，过表达PIG3能够有效缓解这些氧化损伤和线粒体功能障碍。
硒缺乏通过GPX3靶向的PIG3诱导线粒体自噬流阻塞，导致线粒体动力学失衡
透射电镜观察发现，硒缺乏导致脾脏细胞内线粒体数量增多，并出现分裂和自噬体。分子水平上，硒缺乏或GPX3敲低打破了线粒体融合与分裂的平衡，表现为融合蛋白（OPA1， Mfn1， Mfn2）下调，而分裂蛋白（Drp1， Mff， Fis1）上调。尽管自噬标志物LC3II和p62的积累增加，暗示自噬启动，但mCherry-GFP-LC3B双荧光示踪实验揭示，GPX3敲低导致绿色荧光（GFP-LC3B）信号增强而红色荧光（mCherry-LC3B）信号减弱，这表明自噬体与溶酶体的融合步骤被阻断，即线粒体自噬流（mitophagic flux）不通。过表达PIG3可以部分恢复自噬流。
硒缺乏通过GPX3-PIG3轴诱导线粒体DNA泄漏
线粒体自噬是清除受损线粒体及其DNA（mtDNA）的重要机制。当自噬流被阻断时，受损的mtDNA无法被有效降解。研究发现，GPX3敲低导致线粒体转录因子A（TFAM）荧光信号增强，与mtDNA复制、稳定性相关的基因（如TWNK， 12S rRNA， 16S rRNA）表达上调。更重要的是，PicoGreen染色直接显示，GPX3敲低后，DNA荧光（绿色）与线粒体荧光（红色）的重叠减少，表明mtDNA泄漏到了细胞质中。同时，胞质DNA传感器cGAS及其下游信号分子STING、TBK1、IRF3被激活。过表达PIG3能有效减少mtDNA泄漏并抑制cGAS-STING通路的激活。
硒缺乏通过GPX3-PIG3轴驱动异常的Th17细胞分化
机制验证表明，GPX3敲低促进了Th17细胞分化，而过表达PIG3可以抑制这一过程。这直接证明了GPX3/PIG3轴在调控Th17分化中的核心作用。
GPX3-PIG3轴功能障碍通过阻断线粒体自噬和加剧mtDNA释放来驱动Th17细胞分化
为了最终确认“线粒体自噬阻断-mtDNA泄漏”是连接GPX3/PIG3轴与Th17分化的关键环节，研究人员使用了特异性的自噬流抑制剂Bafilomycin A1（Baf-A1）。实验发现，即使在GPX3敲低并过表达PIG3的细胞中，加入Baf-A1也会重新阻断线粒体自噬流，加剧mtDNA泄漏，再次激活cGAS-STING通路，并最终逆转PIG3对异常Th17分化的抑制作用。这确凿地证明，完整的线粒体自噬流对于GPX3/PIG3轴抑制Th17分化至关重要。
综合以上结果，本研究的结论清晰而有力：硒缺乏通过下调GPX3，进而抑制其相互作用蛋白PIG3的表达，这一过程打破了细胞内的氧化还原平衡，诱导线粒体功能障碍和动力学失衡，特别是导致了线粒体自噬流的阻塞。受损的线粒体无法被及时清除，其内部DNA（mtDNA）因此泄漏到细胞质中，作为危险信号激活了cGAS-STING炎症通路，最终驱动了脾脏淋巴细胞的异常Th17分化。这项研究首次揭示了GPX3与PIG3之间存在直接的蛋白互作，并构建了一条完整的“营养代谢（硒）-线粒体质量控（GPX3/PIG3轴）-适应性免疫应答（Th17）”调控轴线。
在讨论部分，作者强调了该研究的深远意义。它不仅从分子层面阐明了硒缺乏引发免疫紊乱的关键机制，将微量元素缺乏、氧化应激、线粒体稳态和自身免疫联系在了一起，而且为临床干预提供了新的思路：GPX3/PIG3信号轴有望成为治疗硒缺乏相关免疫疾病及Th17驱动型自身免疫病（如类风湿关节炎、多发性硬化症等）的潜在新靶点。尽管研究主要基于猪模型，且GPX3和PIG3在人与猪之间的氨基酸序列相似性分别达到81.28%和88.76%，暗示该通路可能在物种间保守，但作者也坦率指出了研究的局限性，例如未涉及其他免疫细胞（如巨噬细胞）在该通路中的作用，以及不同代谢状态和性别因素可能产生的影响。这些都为未来的深入研究指明了方向。总而言之，这项工作为我们理解营养如何精细调控免疫系统打开了一扇新的窗户，并为相关疾病的防治策略开发奠定了重要的理论基础。
