《Journal of Advanced Research》：The module of PeGLK1-1–PeWRKY111–
PePMHA9 orchestrates stomatal aperture to enhance photosynthetic capacity in bamboo
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为揭示毛竹（Phyllostachys edulis）高效光合固碳的分子调控机制，本研究聚焦于控制光合作用的关键环节——气孔开度。研究人员鉴定出一个原膜H+-ATP酶基因PePMHA9，并发现其表达受转录因子PeWRKY111直接激活，而PeWRKY111又能与另一转录因子PeGLK1-1互作，形成PeGLK1-1–PeWRKY111–PePMHA9调控模块。该模块受光信号诱导，共同作用于气孔保卫细胞，通过调控PePMHA9的转录水平来影响气孔开度，从而显著提升毛竹和转基因水稻的光合速率与生物量。此项研究不仅首次在竹子中揭示了气孔调控光合作用的转录级联网络，为理解其卓越固碳能力提供了新见解，也为培育高光合效率的竹子新品种提供了关键靶点基因。
在应对全球变暖的挑战中，森林的固碳能力是自然解决方案的关键一环。毛竹，作为一种生长速度惊人的禾本科植物，其碳汇能力甚至超过了许多热带雨林和针叶林，成为缓解温室效应的“明星物种”。毛竹惊人的生长速度，本质上依赖于其高效的光合作用来制造有机物质。而在光合作用这个复杂的过程中，叶片上的微小气孔扮演着至关重要的“大门”角色——它们控制着二氧化碳（CO2）进入叶片内部的通道。气孔开得越大，CO2供应越充足，光合作用的“原料”也就越丰富。然而，长期以来，科学家们对竹子中究竟哪些基因在操控这扇“大门”，以及它们如何响应环境信号（如光照）来协同工作，仍知之甚少。理解这个调控网络，对于挖掘竹子固碳潜力和指导高光效育种具有重大意义。
为了解开这个谜题，国际竹藤中心的研究团队在《Journal of Advanced Research》上发表了一项研究。他们以毛竹为模型，系统探究了控制其气孔开度、进而影响光合能力的关键基因及其调控机制。研究团队主要运用了整合生理学、转录组学和分子生物学的研究策略。关键技术方法包括：利用LI-6800光合仪和扫描电镜分析毛竹不同叶位叶片的生理指标与气孔形态；通过加权基因共表达网络分析（WGCNA）从转录组数据中筛选关键基因；在毛竹叶片和水稻中进行基因瞬时编辑、过表达和稳定转化以验证基因功能；并通过酵母单杂、双荧光素酶报告、酵母双杂、双分子荧光互补和免疫共沉淀等一系列分子互作实验，解析了转录因子对下游靶基因的调控关系。
研究结果
1. 毛竹不同叶位叶片的光合生理特征
研究人员首先测量了毛竹同一枝条上从顶端（L1）到底部（L5）五个不同位置叶片的光合指标。他们发现，位于L2至L4位置的功能叶具有更高的净光合速率（Pn）和气孔导度（Gs），同时其气孔开度比例也更高。这表明这些叶位是毛竹进行CO2同化和能量供应的主要部位，为后续寻找关键调控基因提供了生理学依据。
2. 毛竹五个叶位的转录组分析
为了从分子层面探究毛竹叶片光合作用的遗传基础，研究者对上述五个叶位的叶片进行了RNA测序。通过加权基因共表达网络分析，他们发现一个粉色模块与净光合速率、气孔导度等光合指标高度相关。在该模块中，他们鉴定出一个编码原膜H+-ATP酶（Plasma Membrane H+-ATPase， PM H+-ATPase）的基因Pe_21959（后命名为PePMHA9）。该基因在光合组织（叶片）中特异性高表达，且其表达模式与净光合速率的变化趋势高度一致，提示它可能是调控竹子光合作用的关键枢纽基因。
3. PePMHA9通过调节气孔开度参与植物光合作用
亚细胞定位实验证实PePMHA9蛋白定位于细胞膜上。RNA原位杂交进一步显示，PePMHA9的转录本在毛竹叶片的气孔保卫细胞中富集，为其调控气孔开度提供了空间证据。该基因的表达受光照诱导，在光下表达升高，在黑暗或弱光下表达降低。通过在毛竹叶片中瞬时敲低或过表达PePMHA9，研究者发现，敲低该基因会降低光系统II（PSII）的最大光化学效率（Fv/Fm）和电子传递速率（ETR II），同时增加非光化学淬灭（NPQ）；而过表达则能提高ETR II，降低NPQ。这表明PePMHA9在毛竹叶片的光合作用中起着关键作用。
为了进一步验证其功能，研究团队在水稻中过表达了PePMHA9。在高光条件下，转基因水稻植株表现出更大的气孔开度、更高的净光合速率和气孔导度，生物量（鲜重和干重）也显著增加。相反，在弱光条件下，这些促进作用不明显。这些结果证明，过表达PePMHA9可以通过促进气孔开放来增强植物的光合能力，从而支持其生长。
4. PeWRKY111通过结合其启动子促进PePMHA9转录
为了阐明PePMHA9的转录调控机制，研究人员从其共表达网络中筛选出与之紧密相关的转录因子PeWRKY111。在PePMHA9的启动子区域发现了三个潜在的WRKY结合位点（W-box）。通过酵母单杂、双荧光素酶报告和GUS活性实验，证实PeWRKY111能够直接结合到PePMHA9的启动子上并激活其转录。进一步的实验将结合位点精确定位到一个特定的W-box基序（5′-GTCAA-3′）上，电泳迁移率变动分析也证实了PeWRKY111蛋白与该DNA序列的直接结合。
5. PeWRKY111与PeGLK1-1互作并协同激活PePMHA9
为了寻找与PeWRKY111协同工作的因子，研究者以PeWRKY111为诱饵进行了酵母双杂交筛选，发现了一个光合作用相关的GOLDEN 2-LIKE（GLK）家族转录因子PeGLK1-1。通过酵母双杂交、双分子荧光互补、GST Pull-down和免疫共沉淀实验，证实PeWRKY111与PeGLK1-1在细胞核内存在直接互作。更重要的是，双荧光素酶报告实验显示，PeWRKY111和PeGLK1-1共同存在时，对PePMHA9启动子的激活作用显著强于PeWRKY111单独存在时，表明两者形成复合体后能协同增强PePMHA9的转录。
6. PeWRKY111和PeGLK1-1过表达增强转基因水稻的光合能力
与PePMHA9类似，PeWRKY111和PeGLK1-1也在毛竹叶片中特异性表达，且受光诱导。在水稻中过表达这两个基因，同样能提升植株在高光下的净光合速率、气孔导度和气孔开度，从而增加生物量。其中，PeGLK1-1的过表达在弱光下也表现出一定的促进作用。这进一步印证了PeWRKY111和PeGLK1-1在调控光合作用中的正向功能。
7. PeGLK1-1、PeWRKY111和PePMHA9共同参与毛竹光合作用
最后，研究者在毛竹叶片中瞬时敲低或过表达了PeWRKY111和PeGLK1-1。敲低任一个基因，都会导致PePMHA9表达下降、ETR II降低和NPQ升高；而过表达它们则能上调PePMHA9表达、提高ETR II并降低NPQ。这些体内实验直接证明了PeGLK1-1、PeWRKY111和PePMHA9在毛竹光合作用中的功能是协同且可操作的。
研究结论与意义
本研究系统阐明了毛竹中一个新颖的光信号介导的转录调控模块：PeGLK1-1–PeWRKY111–PePMHA9。该模块的核心机制是：光信号诱导转录因子PeGLK1-1和PeWRKY111的表达，两者在细胞核内相互作用形成复合体；该复合体随后结合到原膜H+-ATP酶基因PePMHA9的启动子区域，协同激活其转录；高表达的PePMHA9蛋白定位在气孔保卫细胞膜上，通过驱动质子外排、引起膜超极化、促进钾离子内流等一系列生理过程，最终导致气孔开度增大；增大的气孔开度允许更多的CO2进入叶片，从而显著提升光合作用效率，为毛竹的快速生长和强大固碳能力提供了物质和能量基础。
这项研究具有多重重要意义。首先，在理论层面，它首次在竹子这一重要的林业和经济物种中，解析了从光信号感知到气孔运动执行的完整转录调控通路，揭示了其高效光合作用的分子基础，填补了相关领域的知识空白。其次，在应用层面，鉴定出的PePMHA9、PeWRKY111和PeGLK1-1等关键基因，为通过分子育种手段培育具有更高光合效率、更强固碳能力的新竹种提供了宝贵的遗传资源和分子靶点。最后，在生态层面，增强植物的光合固碳效率是应对全球气候变化的重要策略之一，该研究为开发基于植物生理调控的碳中和技术提供了新的思路和基因元件。
