《Journal of Advanced Research》：SQSTM1/p62-mediated PD-L1 biomolecular condensate formation promotes lung tumorigenesis
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本研究揭示了SQSTM1/p62蛋白通过其PB1结构域与PD-L1直接互作，诱导生物分子凝聚体形成并稳定PD-L1蛋白水平的全新机制。这一发现不仅阐明了PD-L1在肿瘤细胞内的一种非免疫性促癌新功能，也为通过靶向破坏SQSTM1/PD-L1凝聚体来治疗非小细胞肺癌等癌症提供了新的潜在治疗策略。
在肿瘤的微观战场上，癌细胞不仅擅长“伪装”自己以逃避免疫系统的追杀，还进化出了多种内在机制来促进自身的存活与生长。程序性死亡配体-1（PD-L1）就是癌细胞手中的一张关键“王牌”。当它出现在癌细胞表面时，可以与免疫T细胞上的PD-1受体结合，像踩下刹车一样抑制T细胞的攻击能力，从而实现免疫逃逸。这也使得针对PD-1/PD-L1轴的免疫检查点抑制剂（如阿特珠单抗，Atezolizumab）成为癌症治疗的一场革命。然而，越来越多的证据表明，PD-L1的促癌能力远不止于此。即使在缺乏免疫细胞的肿瘤微环境中，甚至是在癌细胞内部，PD-L1仍能独立地驱动肿瘤细胞的增殖和生长，这表明PD-L1具有不依赖免疫的、内在的促癌功能。那么，癌细胞是如何精准调控PD-L1蛋白水平，确保其既能发挥免疫抑制功能，又能执行内在促癌信号的呢？这正是当前癌症生物学领域一个亟待解答的关键问题。
与此同时，细胞生物学领域另一个新兴热点——生物分子凝聚体，正在改变我们对细胞内部组织和功能调控的认知。这些由蛋白质、RNA等大分子通过液-液相分离（LLPS）形成的、无膜包裹的动态结构，能够将特定分子富集在局部区域，从而高效调控基因表达、信号传导和蛋白质稳定性等多种生命活动。在癌症中，生物分子凝聚体的失调与多种致癌过程密切相关。其中，一个名为Sequestosome-1（SQSTM1，又称p62）的多功能支架蛋白，被发现能够通过LLPS形成生物分子凝聚体，参与多种癌症的进展。然而，SQSTM1是否会与PD-L1形成“联盟”，通过凝聚体的形式调控PD-L1的稳定性和功能，进而推动肿瘤生长？这一可能性此前从未被探索。发表在《Journal of Advanced Research》上的一项题为“SQSTM1/p62-mediated PD-L1 biomolecular condensate formation promotes lung tumorigenesis”的研究，正是为了揭开这一谜团。
为探究SQSTM1与PD-L1在肺癌发生中的作用，研究者综合运用了多项关键技术。他们首先通过免疫共沉淀和GST pull-down实验在多种肺癌细胞系中证实了两种蛋白的直接相互作用。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建了SQSTM1和PD-L1的基因敲除细胞系，以研究其功能缺失的表型。通过构建一系列SQSTM1截短突变体并结合AlphaFold3蛋白质结构预测模型，确定了SQSTM1中与PD-L1结合的关键结构域。采用免疫荧光染色和共聚焦显微镜观察了SQSTM1/PD-L1生物分子凝聚体的形成与分布。利用小分子化合物1,6-己二醇（1,6-HD）和已获美国食品药品监督管理局批准的PD-L1抗体药物阿特珠单抗来破坏凝聚体，并评估其效果。通过蛋白质稳定性实验（如环己酰亚胺追踪、蛋白酶体抑制剂MG132处理）和泛素化分析，探索了PD-L1的降解途径。最后，研究建立了裸鼠皮下移植瘤模型，在体内验证了基因敲除和药物治疗对肿瘤生长的抑制作用。研究中使用的细胞系包括H460、A549、H1975以及从台湾大学医院新竹分院患者胸水分离的原代PLC26细胞。
结果部分
研究人员在多个非小细胞肺癌细胞系中，通过免疫共沉淀实验证实了SQSTM1与PD-L1之间存在直接的蛋白质相互作用。免疫荧光染色进一步显示，这两种蛋白在细胞质中呈现共定位，特别是在胞质中富集。通过细胞组分分离实验，确认了它们的相互作用主要发生在细胞质区域。体外GST pull-down实验使用从大肠杆菌中纯化的重组蛋白，进一步证实了这种相互作用是直接的，而非通过其他细胞因子介导。
2. SQSTM1的PB1结构域是结合PD-L1的关键
为了确定SQSTM1中负责与PD-L1结合的具体区域，研究者利用AlphaFold3进行了蛋白质结构预测，模型显示SQSTM1的PB1、ZZ、TBS和UBA等多个结构域可能与PD-L1存在相互作用界面。随后，他们构建了一系列SQSTM1的截短突变体（包括ΔUBA、ΔLIR-UBA、ΔTBS-UBA和ΔPB1）。功能实验表明，缺失C端结构域（ΔUBA、ΔLIR-UBA、ΔTBS-UBA）的突变体仍然能够与PD-L1结合，而缺失N端PB1结构域（ΔPB1）的突变体则完全丧失了结合能力。这证明了SQSTM1的PB1结构域是与PD-L1相互作用所必需的。
3. SQSTM1通过PB1结构域介导PD-L1生物分子凝聚体的形成并稳定PD-L1蛋白
过表达全长SQSTM1（FL）或保留PB1结构域的截短体（ΔTBS-UBA）能够显著提升肺癌细胞中PD-L1的蛋白水平，并促进两者形成直径大于1微米的、共定位的生物分子凝聚体。相反，过表达缺失PB1结构域的突变体（ΔPB1）则无法上调PD-L1水平或诱导凝聚体形成。同样地，利用CRISPR/Cas9技术敲除SQSTM1基因，会导致PD-L1蛋白水平下降。这些结果说明，SQSTM1通过其PB1结构域与PD-L1互作，驱动凝聚体的形成，从而稳定PD-L1。
4. 破坏SQSTM1/PD-L1凝聚体可降低PD-L1水平
研究使用了两种策略来破坏SQSTM1/PD-L1凝聚体。一是应用破坏LLPS的化学试剂1,6-己二醇（1,6-HD），它能够溶解已形成的凝聚体，并剂量依赖性地降低PD-L1蛋白水平，同时抑制细胞活力。二是使用抗PD-L1的抗体药物阿特珠单抗，处理细胞后同样观察到了SQSTM1/PD-L1凝聚体的解聚和PD-L1水平的下降。这表明，靶向破坏这种凝聚体是降低PD-L1水平的一种有效策略。
5. SQSTM1通过阻止泛素-蛋白酶体降解途径来稳定PD-L1
蛋白质稳定性实验发现，在SQSTM1敲除的细胞中，PD-L1的半衰期缩短，对蛋白质合成抑制剂环己酰亚胺（CHX）更为敏感。蛋白酶体抑制剂MG132的处理可以挽救SQSTM1敲除导致的PD-L1降解。进一步的泛素化分析显示，当SQSTM1与PD-L1结合时（例如过表达全长SQSTM1），PD-L1上的K48连接型多聚泛素化修饰减少；而当两者的相互作用被破坏（例如过表达ΔPB1突变体）时，PD-L1的K48泛素化水平显著增加。K48连接的多聚泛素化链是引导蛋白质进入蛋白酶体降解的主要信号。因此，该结果证实SQSTM1通过与PD-L1结合形成凝聚体，保护其免遭泛素-蛋白酶体途径的降解。
6. SQSTM1/PD-L1凝聚体促进肺癌细胞增殖和体内肿瘤生长
功能实验表明，敲除SQSTM1或PD-L1均能显著抑制肺癌细胞的增殖。机制上，敲除任一基因都会导致细胞增殖关键蛋白Survivin（存活蛋白）及其磷酸化形式（p-survivinT34）和细胞周期蛋白CDK1的表达下调。更重要的是，在裸鼠皮下移植瘤模型中，与对照组相比，敲除SQSTM1或PD-L1的肿瘤生长速度明显减缓，最终形成的肿瘤体积更小。对肿瘤组织的分析显示，在对照组的肿瘤中存在明显的SQSTM1/PD-L1凝聚体，而敲除组的肿瘤中则观察不到。这表明SQSTM1/PD-L1凝聚体在体内外均能促进肿瘤生长。
7. 阿特珠单抗通过靶向SQSTM1/PD-L1凝聚体抑制肿瘤生长
体内药效实验进一步验证了靶向该凝聚体的治疗潜力。在携带野生型H1975肿瘤的裸鼠中，阿特珠单抗治疗能显著抑制肿瘤生长；然而，在携带SQSTM1敲除的H1975肿瘤的裸鼠中，阿特珠单抗的抑瘤效果则不明显。对肿瘤组织的免疫荧光分析证实，阿特珠单抗处理能有效破坏野生型肿瘤中的SQSTM1/PD-L1凝聚体，但在敲除肿瘤中无此效应。这表明，阿特珠单抗的抗肿瘤作用至少部分依赖于其对SQSTM1/PD-L1凝聚体的破坏，揭示了该抗体药物一种不依赖于免疫系统的新型作用机制。
本研究系统性地揭示了SQSTM1/p62通过其PB1结构域与PD-L1直接相互作用，并驱动两者形成生物分子凝聚体。这种凝聚体结构犹如一个“保护罩”，能够将PD-L1隔离在细胞质内，使其免受由K48连接的多聚泛素化标记所介导的蛋白酶体降解，从而稳定了PD-L1的蛋白水平。稳定的PD-L1进而通过上调Survivin等促增殖蛋白的表达，独立于其免疫检查点功能，直接促进肺癌细胞的增殖和体内肿瘤的生长。研究创新性地将癌症生物学中的两个重要概念——生物分子凝聚体和PD-L1的肿瘤内在功能——联系起来，为理解PD-L1的促癌机制提供了全新视角。
研究的另一个重要发现在于其临床转化意义。研究证明，已上市的PD-L1抗体药物阿特珠单抗能够破坏SQSTM1/PD-L1凝聚体，并且其在动物模型中的抗肿瘤效果依赖于SQSTM1的存在。这提示，除了众所周知的阻断PD-1/PD-L1免疫检查点通路外，抗体药物还可能通过瓦解肿瘤细胞内部的促生存信号复合物来发挥疗效。此外，能够破坏LLPS的小分子化合物（如1,6-HD）也为开发靶向此类凝聚体的新型抗癌药物提供了思路。最后，基于公共数据库的分析显示，高表达的SQSTM1和PD-L1均与肺癌患者的不良预后显著相关，进一步支持了该通路的临床相关性。
总之，这项研究不仅阐明了SQSTM1/PD-L1生物分子凝聚体在肺肿瘤发生中的关键作用及分子机制，还验证了靶向破坏该凝聚体作为一种潜在治疗策略的可行性。它拓展了我们对PD-L1生物学功能的认识，并为改善现有免疫治疗疗效及开发新型抗癌疗法提供了重要的理论依据和新靶点。
