《Journal of Advanced Research》：Identification of a novel EphB4 inhibitor, Sanguinarine, which attenuates β-catenin signaling to inhibit tumor proliferation and migration in lung cancer
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【编者推荐】为探索肺癌治疗新靶点，本研究揭示了受体酪氨酸激酶EphB4在肺癌中的促癌作用，并首次发现天然化合物血根碱(Sang)可作为EphB4新型抑制剂。Sang通过抑制EphB4磷酸化、阻断其与β-连环蛋白相互作用并促进后者泛素化降解，进而抑制上皮-间质转化(EMT)，在体内外均显著抑制肿瘤生长与转移。该研究为肺癌靶向治疗提供了新的候选药物与作用机制。
肺癌是全球癌症相关死亡的主要原因，其中非小细胞肺癌(NSCLC)约占85%。尽管手术、放化疗和免疫治疗取得了进展，但晚期患者的治疗选择仍然有限，疗效欠佳，迫切需要开发新的抗癌药物。受体酪氨酸激酶EphB4在多种癌症中过表达，被认为是肿瘤生长的促进因子和潜在的治疗靶点。然而，其在肺癌发展中的具体作用及其调控机制尚不明确，这成为了一个亟待填补的知识缺口。与此同时，源于植物(如博落回、白屈菜、血根草)的天然化合物血根碱(Sanguinarine, Sang)已被证明在乳腺癌、前列腺癌和结直肠癌中具有抗癌特性，但其在肺癌中的作用机制，特别是是否靶向EphB4相关通路，仍是未知数。为此，来自浙江大学医学院附属人民医院的研究团队开展了一项研究，旨在揭示EphB4在肺癌进展中的功能，评估Sang作为EphB4特异性抑制剂的潜力，并阐明其分子机制。该研究成果发表在《Journal of Advanced Research》上。
为了回答上述问题，研究人员综合运用了生物信息学分析、分子对接与动力学模拟、细胞功能实验(如MTT、克隆形成、Transwell迁移、划痕实验)、蛋白质相互作用研究(如免疫共沉淀、泛素化分析)、以及裸鼠皮下移植瘤模型等关键技术方法。研究使用了来自浙江人民医院的7对肺癌患者样本及配对癌旁组织，并在多种肺癌细胞系(如H1299, H522)中进行了验证。
研究结果
EphB4在肺癌中高表达并促进肿瘤进展
研究人员通过分析TCGA等公共数据库和肺癌患者组织样本发现，EphB4在肺癌肿瘤组织中的表达量显著高于癌旁正常组织，且高表达与患者不良预后相关。在肺癌细胞系中，EphB4同样高表达。功能实验表明，过表达EphB4(EphB4-OE)或用其配体EphrinB2 Fc激活，能显著促进肺癌细胞(H1299, H522)的增殖、克隆形成、迁移和侵袭能力，证实了EphB4在肺癌中的致癌作用。
Sang是EphB4的高效选择性抑制剂
通过虚拟筛选近2万种天然化合物，Sang以最高的对接得分(-10.115 kcal/mol)被确定为与EphB4结合的最佳候选分子。体外结合实验(微尺度热泳动，MST)证实Sang与EphB4蛋白具有高亲和力(250 nM)。分子动力学模拟显示Sang与EphB4的结合稳定。在功能上，Sang能以剂量依赖的方式抑制肺癌细胞增殖，并显著减少克隆形成。在H522细胞裸鼠移植瘤模型中，Sang治疗(3和6 mg/kg)可分别使肿瘤体积减小70%，肿瘤质量减少60%，且未观察到明显毒性。
Sang的抗肿瘤效应依赖于EphB4的表达
研究发现，EphB4过表达的肺癌细胞对Sang处理更敏感。在体内，Sang能显著抑制EphB4过表达的H1299细胞移植瘤的生长。Transwell和划痕实验表明，Sang能有效抑制肺癌细胞的迁移和侵袭，且在EphB4过表达或EphrinB2 Fc激活的细胞中抑制作用更强。即使在使用TGF-β(转化生长因子-β)诱导上皮-间质转化(EMT)和迁移增强的条件下，Sang也能有效抑制这种促迁移效应，并且与已知的EphB4激酶抑制剂NVP-BHG712联用具有协同作用。
Sang通过干扰EphB4-β-连环蛋白信号通路抑制肺癌细胞
通路富集分析和基因本体(GO)分析提示EphB4与β-连环蛋白(β-catenin)结合相关。TCGA数据和免疫组化证实，在肺癌组织中EphB4与β-连环蛋白的表达呈正相关。分子对接揭示了EphB4与β-连环蛋白相互作用的可能界面。机制上，Sang直接结合EphB4，抑制其磷酸化，并破坏EphB4与β-连环蛋白之间的相互作用。这导致β-连环蛋白的磷酸化水平增加，进而被泛素化并通过蛋白酶体途径降解。免疫荧光和Western blot结果显示，Sang处理能阻止β-连环蛋白向细胞核内转移，降低其总蛋白水平，并增加其磷酸化形式(p-β-catenin)的比例。
Sang抑制上皮-间质转化(EMT)相关标志物表达
由于EphB4-β-连环蛋白信号驱动EMT，研究人员进一步检测了EMT相关标志物。Sang处理可上调上皮标志物E-钙黏蛋白(E-cadherin)的表达，同时下调间质转录因子Snail以及基质金属蛋白酶MMP2和MMP9的表达。在TGF-β刺激的促EMT条件下，Sang能有效逆转这些EMT相关分子的变化，且与NVP-BHG712联用效果更佳。此外，Sang还能抑制血管内皮生长因子VEGFA的表达，提示其可能同时具有抗血管生成作用。
Sang抑制EphB4磷酸化并促进其泛素化降解
深入机制研究表明，Sang能以剂量依赖的方式抑制EphB4的磷酸化。分子对接显示，Sang结合在EphB4酪氨酸激酶结构域的ATP结合口袋中，与关键氨基酸残基(如LYS-647, ARG-763)形成氢键，从而稳定其非活性构象。研究还发现，胰岛素样生长因子II(IGF-II)信号可通过磷酸化EphB4第987位酪氨酸(Tyr987)来保护EphB4免于降解。而Sang能够抑制IGF-II的表达和EphB4在Tyr987位点的磷酸化，从而促进EphB4发生多聚泛素化，并通过蛋白酶体途径被降解。这种促进EphB4降解的机制是Sang所特有的，因为激酶抑制剂NVP-BHG712并未表现出此效应。
结论与讨论
本研究系统阐明了EphB4在肺癌进展中的关键作用。EphB4在肺癌中高表达，并通过配体非依赖性的方式促进肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭。更重要的是，研究首次发现天然化合物血根碱(Sang)是一种新型、高效的EphB4抑制剂。
Sang通过一种前所未有的双重机制发挥抗肿瘤作用：首先，它直接结合EphB4的ATP口袋，抑制其激酶活性；其次，它通过抑制IGF-II介导的EphB4磷酸化(Tyr987)，促进EphB4的泛素化和蛋白酶体降解。这种对EphB4蛋白水平的直接下调，与单纯抑制其激酶活性的药物(如NVP-BHG712)的作用机制不同，二者甚至可能产生协同效应。
在信号传导层面，Sang破坏EphB4与β-连环蛋白的相互作用，导致β-连环蛋白磷酸化、泛素化并最终被降解。这进而抑制了β-连环蛋白的核转位及其下游靶基因(如Snail, MMPs)的转录，从而逆转上皮-间质转化(EMT)，抑制肿瘤的迁移、侵袭和血管生成(VEGFA下调)。
这项研究的意义重大。它不仅明确了EphB4作为肺癌治疗新靶点的价值，还为临床转化提供了一个极具前景的候选药物——血根碱。Sang源于天然产物，在临床前模型中显示出强效的抗肿瘤活性和良好的安全性。其独特的作用机制(促进靶蛋白降解)为开发EphB4靶向疗法提供了新思路。未来，针对EphB4高表达患者的生物标志物驱动临床试验，以及Sang与现有疗法(如化疗、免疫治疗或其他靶向药)的联合应用探索，将有望为肺癌患者带来新的治疗希望。当然，研究也存在一定局限，如患者样本量较小，EphB4配体依赖性信号在肺癌中的复杂角色也有待未来进一步研究。尽管如此，这项结合计算预测与严格实验验证的研究，为Sang作为肺癌治疗药物的临床开发提供了坚实的临床前依据。
