《Interdisciplinary Medicine》：A dendrimer enhanced CRISPR/Cas12a performance for the evaluation of acidogenic capacity in cariogenic bacteria
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本文针对致龋细菌（如变形链球菌）产酸能力的临床快速评估难题，创新性地设计了一种功能核酸材料。研究通过杂交链式反应（HCR）构建CRISPR/Cas12a树状聚集体（CDA），显著提升了Cas12a酶的局部密度与转切酶活性，并与pH响应的DNA三联体开关结合，开发出无需设备、现场可用的折纸生物传感器（CDEOB）。该传感器对唾液中变形链球菌的检测限低至98.1 CFU/mL，并在101份临床样本中得到验证，为龋病的早期诊断与防控提供了创新的即时检测（POC）平台。
研究背景与意义
龋病是一种全球范围内普遍存在的慢性感染性疾病，其根本驱动因素是致龋菌（如变形链球菌）的产酸代谢。这些细菌代谢膳食糖分产生有机酸，导致牙釉质脱矿。准确评估细菌的产酸能力对于龋病的早期诊断和预防至关重要。然而，现有的检测方法（如培养法、聚合酶链式反应、酶联免疫吸附测定）无法评估功能性产酸能力，而能够测量产酸的专用系统（如pH-stat自动滴定和糖酵解pH下降实验）则需要复杂的仪器设备。因此，迫切需要开发灵敏度高、快速且无需设备、能够可靠测量口腔细菌产酸能力的用户友好型检测方法。
pH响应性CRISPR/Cas树状大分子增强折纸生物传感器的机理研究
本研究巧妙地通过杂交链式反应（HCR）构建了一种树状DNA纳米结构，以增加Cas12a蛋白的结合位点，从而显著增强其催化活性并提高检测灵敏度。基于此，我们开发了一种用于评估变形链球菌产酸能力的pH响应性CRISPR/Cas树状大分子增强折纸生物传感器。具体而言，crRNA通过一个pH响应性序列连接到纸质器件的样品区，蔗糖也预沉积在该区域。同时，通过HCR制备含有Cas12a激活序列的树状扩增产物，并将其固定在反应区。当存在产酸致龋菌时，蔗糖被代谢产酸，导致pH值下降，进而释放出crRNA。折叠CDEOB器件使样品区与流动区接触，反应区与显色区接触。释放的crRNA迁移至反应区，与预先固定的Cas12a蛋白结合并整合到CDA中，激活其转切酶活性。激活后的CDA则切割显色区中与信号报告分子（如荧光或比色标记）连接的ssDNA，产生可测量的信号。通过利用CDA增强的催化效率，该系统在折纸结构的纸质传感器上放大了输出信号，实现了对致龋菌产酸能力的快速、灵敏和现场检测。此设计概念可通过示意图清晰展现。
CRISPR/Cas树状聚集体的合成与表征
CDA是通过在硝酸纤维素膜表面进行树状HCR合成的。生物素化的H2通过链霉亲和素-生物素相互作用锚定在NC膜表面。加入部分互补的H1和H2后，H1链的尾部与膜上的H2尾部杂交，打开H1和H2的茎环结构，暴露出新的单链区域。H1和H2的交替杂交导致了树状DNA聚合物的形成，作为CDA的支架。然后，Cas12a-crRNA复合物通过互补序列与树状DNA聚合物结合，得到CDA。聚丙烯酰胺凝胶电泳图像中L3处的涂抹条带证明了树状DNA聚合物的成功形成。高内涵荧光显微镜图像进一步证实了树状DNA聚合物在磁珠表面的形成。实验对关键组分进行了优化，包括Bio-H2、H1/H2的浓度、扩增温度和时间以及Cas12a-crRNA的量。移除关键组分的反应结果显示，只有在所有组分都存在时，才能形成具有高催化活性的CDA，相关合成路径与表征结果详见图示。
CRISPR/Cas树状聚集体的催化效率
在优化的转切酶催化反应条件下，包括pH值、温度以及Mg2+浓度，CDA表现出最高的转切酶活性。同时，Mn2+的添加并未显著增强CDA的转切酶活性。通过构建Cas12a蛋白结合率与荧光强度的标准曲线，计算出树状DNA聚合物上Cas12a蛋白的结合率为53%。
为进一步研究不同条件下CRISPR/Cas系统的催化效率，对游离溶液中的CRISPR/Cas-crRNA系统、单独锚定在NC膜上的CRISPR/Cas-crRNA系统、无Mg2+锚定在NC膜上的CDA以及锚定在NC膜上的CDA进行了米氏动力学研究。结果显示，NC膜上的CDA表现出最高的kcat和kcat/Km值。与游离系统和单独在NC膜上的CRISPR/Cas系统相比，NC膜上CDA的催化常数分别高出1.15和2.42倍，特异性常数分别高出1.12和2.12倍。此外，与无Mg2+的CDA相比，CDA的催化常数高出10.04倍，特异性常数高出9.86倍，表明Mg2+在CRISPR/Cas系统的催化活性中起着关键作用。这些结果证实，在NC膜上形成CDA显著增强了CRISPR/Cas系统的转切酶效率。此外，对制备的CDA进行了长期储存稳定性评估，在-20°C储存15周后，其催化活性仍保持在初始活性的97%以上，展示了优异的储存稳定性，这为CDA在纸基传感器中的应用提供了重要依据，相关动力学曲线见图示。
pH响应性序列与致龋细菌产酸能力
与合成材料相比，具有固有可编程性和生物相容性的天然DNA分子是设计和构建智能分子器件的优秀候选者。pH响应性DNA序列可以响应环境pH值的变化而发生构象或功能改变。我们设计了一条包含三联体序列的DNA链来连接crRNA，实现了crRNA的pH响应性释放。高内涵荧光图像显示，随着pH值降低，磁珠上的荧光强度逐渐减弱，这归因于在酸性条件下，pH响应性DNA从展开的线性结构转变为折叠的三联体结构，导致TAMRA标记的DNA从磁珠上释放。在NC膜上的进一步研究也证实了pH响应性链的释放。
变形链球菌是一种与龋病发生相关的常见口腔细菌，它通过糖酵解途径代谢蔗糖产酸。其产酸能力与其致龋性直接相关。因此，评估其产酸能力可以评估龋病的发病风险，为龋病的预防和治疗提供依据。研究优化了蔗糖浓度和温度等反应条件，考察了不同浓度变形链球菌的产酸动力学。随着变形链球菌浓度从104CFU/mL增加到108CFU/mL，pH值逐渐下降。通过在NC膜上添加变形链球菌和蔗糖，并对洗脱液进行荧光光谱分析，发现随着变形链球菌浓度的增加，荧光信号增强，这归因于变形链球菌在NC膜上水解蔗糖降低pH值，导致三联体序列折叠并释放TAMRA标记的DNA。这些结果为利用pH响应性链释放分析变形链球菌奠定了基础，相关实验验证过程如图所示。
使用CDEOB分析致龋细菌
研究探索了pH响应性树状CRISPR/Cas增强折纸生物传感器用于快速评估变形链球菌的产酸能力。CDEOB的样品区通过链霉亲和素-生物素系统锚定pH响应性序列，通过碱基互补配对连接crRNA，并在该区域沉积蔗糖。同时，反应区锚定树状DNA聚合物，并沉积Cas12a、Mg2+和PBS缓冲液。折纸器件的设计实现了样品区与含有CDA的反应区之间的空间隔离，确保CDA在整个检测过程中保持最佳且稳定的缓冲环境，不受样品pH值的影响。显色区通过ssDNA连接AuNPs或FAM作为比色或荧光信号输出元件。
验证了比色和荧光信号输出的可行性。反应区用含有或不含Cas12a-crRNA复合物的树状DNA聚合物修饰，而显色区用AuNPs或FAM修饰。在存在Cas12a-crRNA复合物的情况下，观察到更高的比色CDEOB强度和更低的荧光CDEOB强度，对应的CDEOB图像也显示出更浅的红色和更弱的荧光信号。这归因于CDA的形成和激活，转切了连接信号输出元件的ssDNA，从而减少了显色区中AuNPs和FAM的量。进一步优化了显色区中AuNPs和FAM的结合量，确定了其最佳浓度。
使用建立的CDEOB检测变形链球菌。在优化的反应条件下，使用比色CDEOB和荧光CDEOB分析了不同浓度的变形链球菌，并给出了相应的结果。随着变形链球菌浓度从102CFU/mL增加到109CFU/mL，比色CDEOB的颜色强度逐渐增加，荧光CDEOB的荧光强度逐渐降低。比色CDEOB的颜色强度在103至107CFU/mL的浓度范围内与变形链球菌浓度的对数值呈线性关系，检测限为4.2×102CFU/mL。荧光CDEOB的荧光强度在103至109CFU/mL的浓度范围内与变形链球菌浓度的对数值呈线性下降关系，检测限为1.1×102CFU/mL，相关性能建立数据见图示。
CDEOB的分析性能
通过在人工唾液中检测变形链球菌，进一步评估了CDEOB的分析性能，包括灵敏度、日内精密度和日间精密度。随着变形链球菌浓度的增加，比色CDEOB的颜色逐渐减弱，颜色强度增加，而荧光CDEOB的荧光强度和信号强度逐渐下降。这可以解释为，更高的变形链球菌浓度导致更多的pH响应性链释放，从而在CDA上形成更多的Cas12a-crRNA复合物，转切了更多的信号报告分子。进一步分析变形链球菌浓度与比色CDEOB颜色强度值的相关性，发现在103至107CFU/mL的浓度范围内存在显著的线性关系，检测限为9.7×102CFU/mL。荧光CDEOB的荧光强度值进一步用于变形链球菌的定量分析，观察到荧光强度值与变形链球菌浓度的对数值在102至108CFU/mL范围内成反比，检测限低至98.1 CFU/mL。进一步对变形链球菌其他菌株进行定量分析，也揭示了其浓度与CDEOB颜色强度及荧光强度值之间的显著线性关系。此外，评估了CDEOB的特异性，结果表明该平台对临床相关产酸能力具有功能特异性。
进一步研究了CDEOB的精密度。通过测量一天内不同时间点的人工唾液样品评估日内精密度，比色CDEOB和荧光CDEOB的回收率变化范围分别为90.58%至110.66%和94.27%至119.24%，平均相对标准偏差分别为4.47%和1.81%。通过连续一周每天测量人工唾液样品评估日间精密度，比色CDEOB和荧光CDEOB的回收率分别为95.61%至103.56%和77.78%至119.49%，平均相对标准偏差分别为4.94%和4.56%。为评估CDEOB用于现场检测的适用性，研究了其储存稳定性。结果表明，CDEOB在储存30天后，对变形链球菌的检测仍能保持较高的回收率，证明了其良好的储存稳定性，凸显了其可靠现场检测变形链球菌的潜力，相关性能评估数据汇总见图示。
临床唾液样本中致龋细菌的检测
口腔细菌的产酸能力与龋病风险直接相关，细菌产酸量越高通常意味着龋病风险越高。因此，评估唾液中口腔细菌的产酸能力可以作为预测个体龋病风险的关键指标。本工作收集了临床唾液样本，使用定量聚合酶链式反应方法检测唾液中的变形链球菌16S rDNA，同时使用建立的比色CDEOB和荧光CDEOB分析唾液样本。根据定量聚合酶链式反应结果，将101份唾液样本分为阴性组和阳性组。CDEOB的高强度值和低强度值分别表明临床唾液样本中存在变形链球菌，并且CDEOB的强度值与定量聚合酶链式反应的Cq值具有良好的相关性。箱形图显示，CDEOB检测到的阳性和阴性样本的强度值存在显著差异。此外，通过Bland-Altman分析进一步证明了CDEOB与定量聚合酶链式反应之间的一致性。与101份唾液样本的定量聚合酶链式反应结果相比，比色CDEOB和荧光CDEOB分别有94%和95%的数据点落在一致性界限内，证实了CDEOB方法与定量聚合酶链式反应方法之间的一致性。CDEOB的受试者工作特征曲线分析显示，比色CDEOB和荧光CDEOB的曲线下面积分别为0.8561和0.7810，接近1。混淆矩阵证明了CDEOB方法与定量聚合酶链式反应在检测变形链球菌方面具有良好的一致性。这些结果表明，建立的CDEOB方法可以有效地应用于检测临床唾液样本中变形链球菌的产酸能力，并评估早期龋病风险，临床样本分析详情见图示。
结论
总而言之，我们开发了一种以功能核酸材料创新设计为核心的pH响应性CRISPR/Cas树状大分子增强折纸生物传感器，用于评估细菌产酸能力和预测龋病风险。核心创新在于通过HCR工程化构建了可编程的Cas12a树状聚集体，这代表了功能性DNA纳米技术的重大进步。这种理性设计的树状DNA纳米结构作为一种高密度固定基质，显著提高了局部Cas12a浓度和催化效率。该系统进一步整合了一个智能的pH响应性DNA三联体开关，能够响应细菌产酸而精确释放crRNA。这些功能核酸元件共同构成了一个集成的传感级联，将生化活性转化为可测量的信号。当暴露于致龋菌时，pH诱导的结构转换触发crRNA释放以及活性CDA复合物的后续自组装，最终实现对报告分子的高效转切。CDEOB表现出卓越的性能，具有从102至108CFU/mL的宽线性范围和低至98.1 CFU/mL的检测限，同时通过101份临床样本测试验证了其优异的精密度。这项工作建立了一个新的范式，用于设计基于功能核酸的架构，该架构将分子识别、信号放大和刺激响应行为结合在一个便携式生物传感平台中，为即时诊断应用提供了巨大潜力。值得注意的是，该检测方法专门评估样品的产酸能力，但不能识别存在的特定致龋菌种类。其在复杂临床微生物组中的性能因此需要进一步研究。通过调整响应性核酸设计，所开发的平台可用于检测其他临床相关的生物标志物。
