使用搅拌棒辅助的磁性分散固相萃取技术结合高效液相色谱-质谱（HPLC-MS/MS）对肝移植受者全血样本中的环孢素进行定量分析

《Journal of Chromatography A》：Quantitative analysis of cyclosporine in whole blood samples of liver transplant recipients using a stir bar–assisted magnetic dispersive solid phase extraction combined with HPLC–MS/MS

本研究开发了一种搅拌棒辅助磁分散固相萃取结合高效液相色谱-串联质谱法，用于肝移植受者全血中环孢素A的定量分析。通过优化吸附剂、搅拌速率和时间等参数，该方法灵敏度达0.20 ng/mL，回收率80%，线性范围0.69-500 ng/mL，RSD≤6.2%。实验验证了其在临床样本中的应用，测得环孢素A浓度范围为140.5-196.9 ng/mL。

　　

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伊朗卡拉杰阿尔博兹医科大学药学院药理学系

摘要

环孢素A是一种免疫抑制药物，用于器官移植和自身免疫性疾病的治疗。此外，它还被批准作为肝移植受者的肝保护剂使用。环孢素的主要毒性副作用是肾毒性，由于其治疗指数较窄，因此必须个体化调整剂量。在本研究中，介绍并验证了一种基于磁分散固相萃取法的样品处理方法，随后结合高效液相色谱-串联质谱技术，用于定量分析肝移植受者全血样本中的环孢素A含量。该方法包括：向样品溶液中加入15毫克的Fe₃O₄@生物金属有机框架-分子印迹聚合物，使用搅拌棒进行分散；将吸附了分析物的吸附剂颗粒收集到搅拌棒上；然后将搅拌棒转移到含有洗脱液的试管中，重新开始搅拌以洗脱分析物；最后将液相蒸发，残渣溶解在流动相中并通过高效液相色谱-串联质谱进行分析。优化了吸附步骤中的吸附剂用量、搅拌速率和时间、样品溶液的离子强度和pH值、洗脱剂的类型和体积以及解吸步骤中的搅拌速率和时间等关键参数。在最佳条件下，该方法实现了低检测限（0.20 ng/mL^–1）、高定量限（0.69 ng/mL^–1）、良好的提取回收率（80%）和精确度（相对标准偏差≤6.2%）。通过分析肝移植受者的血液样本，验证了该方法的有效性，结果显示样本中的环孢素A浓度范围为140.5–196.9 ng/mL^–1。

引言

肝移植是目前治疗终末期肝病和肝细胞癌的唯一根治方法[1]。移植的成功率取决于患者的免疫反应。抗体介导的免疫排斥或细胞排斥是器官移植领域的主要挑战，可能导致移植失败甚至受者死亡[2]。因此，术后需要使用免疫抑制药物（如环孢素A）来预防器官排斥[3]。环孢素A是一种已知的免疫抑制药物，属于钙调神经磷酸酶抑制剂，可抑制T细胞的产生和活化[4]。为了准确调整药物剂量并避免治疗失败或副作用，准确测定患者生物样本中的药物浓度至关重要[5]。由于环孢素A的治疗指数较窄且药代动力学变化较大，定量分析尤为重要。低浓度药物会降低治疗效果，而高浓度则会导致毒性[6]。由于环孢素A有41–58%分布于红细胞中，因此通常对其在全血样本中进行分析[7]。因此，开发适用于肝移植受者血液样本中环孢素A的分析方法至关重要。根据文献，高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）是分析环孢素A的常用且理想的技术[8,9]。尽管仪器有所改进，但在分析生物样本中的药物之前仍需进行样品预处理。血液、血浆和尿液等生物样本属于复杂基质，含有盐类、蛋白质、大分子和其他有机化合物[10]。固相萃取（SPE）是一种常用的药物提取方法[11]。然而，该方法存在操作繁琐、耗时以及柱子堵塞的可能性[13]。为了解决这些问题，引入了多种新型SPE技术，包括磁固相萃取（MSPE）[14]、分散固相萃取（DSPE）[15]和磁分散固相萃取（MDSPE）[16]。在这些方法中，吸附剂颗粒直接加入样品溶液中，而非装填在柱子中。其中，MDSPE因其简单、经济、快速且效率高而被广泛采用[17]。该方法首先将磁性吸附剂分散到样品溶液中以吸附目标分析物，然后利用外部磁铁收集吸附剂颗粒并去除液相，再用适宜溶剂冲洗吸附剂以解吸分析物[18]。吸附剂的选择对MDSPE的效果至关重要[19]。近年来，纳米级吸附剂（如金属有机框架MOFs）因其优异性能（高稳定性、大表面积、可调物理性质和易于合成）而受到关注[20]。MOFs由金属阳离子与羧酸、胺等多齿有机连接剂连接而成[21]。最近，一种称为生物MOFs的新类型MOFs被开发出来，它们利用氨基酸、卟啉和肽等生物内源性有机配体制备[22]。尽管MOFs在吸附分析物方面表现出高效，但生物样本中的其他物质和分子可能会影响萃取的选择性。通过将MOFs与分子印迹聚合物（MIPs）结合，可以解决这一问题。MIPs含有为模板分子设计的特异性空腔，从而在聚合过程中形成人工受体，实现目标化合物的选择性吸附。

本研究开发了一种基于磁分散固相萃取法的样品处理方法（SB-MDSPE），结合高效液相色谱-串联质谱技术，用于测定肝移植受者全血样本中的环孢素A含量。该方法结合了搅拌棒吸附萃取（SBSE）和MDSPE的优点，同时避免了各自的缺点（SBSE中吸附剂在搅拌棒上的涂层困难以及MDSPE中吸附剂在样品溶液中的分散问题）。本研究的新颖之处在于采用简单环保的方法合成了Fe₃O₄@bio-MOF@MIP复合吸附剂，并将其作为可重复使用的高效吸附剂用于萃取过程。MIP的选择性、MOF的大表面积以及复合材料的磁性质使其成为MDSPE的理想选择。由于吸附剂的磁性质，该方法不仅易于操作，还节省了时间（无需过滤和离心步骤）。据我们所知，这是首次将该方法用于人类血液样本中环孢素A的选择性定量分析。

化学品

环孢素A标准粉末购自美国马萨诸塞州伯灵顿的Merck-Millipore公司。HPLC级乙腈（ACN）、HPLC级甲醇、HPLC级水、硫酸锌（ZnSO₄）、盐酸（37%，w/w）、氯化钠（NaCl）、氢氧化钠、甲酸、乙醇和丙酮均购自德国达姆施塔特的Merck公司。维生素B₃、甲基丙烯酸（MAA）、六水合氯化钴（II）（CoCl₂·6H₂O）、乙二醇二甲基丙烯酸酯（EGDMA）、2-偶氮异丁腈（AIBN）和铁等试剂也来自Merck公司。

Fe₃O₄@bio–MOF@MIP的表征

合成的磁性复合材料通过FTIR、SEM、XRD、VSM和BET进行了表征。图2显示了Fe₃O₄@bio–MOF和Fe₃O₄@bio–MOF@MIP复合材料的FTIR光谱。比较光谱后发现，1623 cm^–1处的峰对应于尼古丁酸中C=O键的伸缩振动；445 cm^–1处的峰与Co–N键的振动相关，证实了bio–MOF的成功制备。

结论

本研究描述了一种基于固体吸附剂的样品预处理方法（SB-MDSPE）。这是首次将该方法用于从肝移植受者全血样本中提取环孢素A，并通过HPLC-MS/MS进行测定。结果表明，Fe₃O₄@bio–MOF@MIP是一种适用于环孢素A选择性提取的吸附剂。这些纳米吸附剂可重复使用多次。

作者贡献

阿里·马什哈迪（Ali Mashhadi）：数据分析与验证。 阿里·阿克巴尔·法蒂（Ali Akbar Fathi）：实验研究与合成。 扎赫拉·阿塔伊（Zahra Ataie）：审阅与编辑。 阿里·莫赫比（Ali Mohebbi）：方法学设计、初稿撰写。 萨伊德·亚里普尔（Saeid Yaripour）：项目监督、方法学指导、数据管理、概念构建、撰写与审阅、项目管理。

未引用参考文献

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CRediT作者贡献声明

阿里·马什哈迪（Ali Mashhadi）：验证与数据分析。 阿里·莫赫比（Ali Mohebbi）：初稿撰写与方法学设计。 阿里·阿克巴尔·法蒂（Ali Akbar Fathi）：实验研究与数据分析。 扎赫拉·阿塔伊（Zahra Ataie）：审阅与编辑。 萨伊德·亚里普尔（Saeid Yaripour）：撰写与审阅、项目监督、方法学指导、数据管理、概念构建。

利益冲突声明

作者声明不存在可能影响本文研究的财务利益或个人关系。

致谢

作者感谢伊朗卡拉杰阿尔博兹医科大学的研究与技术副校长办公室的支持。本研究获得了阿尔博兹医科大学伦理委员会的批准（批准代码：IR.ABZUMS.REC.1402.358）。