维加巴特林（vigabatrin）、加巴喷丁（gabapentin）和普瑞巴林（pregabalin）在多孔石墨碳上的色谱分离：在治疗药物监测中的应用

《Journal of Chromatography B》：Chromatographic separation of vigabatrin, gabapentin and pregabalin on porous graphitic carbon: Application in therapeutic drug monitoring

抗癫痫药物vigabatrin、gabapentin和pregabalin采用梯度洗脱结合0.1% trifluoroacetic acid和acetonitrile流动相，在porous graphitic carbon固定相上实现高效分离，通过D4-pregabalin内标和 perchloric acid蛋白沉淀前处理，建立质谱检测方法，验证显示该方法准确性和精密度符合临床需求，适用于常规血药浓度监测。

　　

Jens Martens-Lobenhoffer | Stefanie M. Bode-B?ger

德国马格德堡奥托·冯·格里克大学临床药理学研究所

摘要

抗癫痫药物维加巴特林（vigabatrin）、加巴喷丁（gabapentin）和普瑞巴林（pregabalin）具有极性和亲水性，因此在反相固定相上难以保留。在本研究中，我们使用多孔石墨碳作为固定相，通过梯度洗脱法（流动相为0.1%三氟乙酸和乙腈）对这些物质进行了色谱分离。样品制备过程包括加入稳定同位素标记的内标D₄-普瑞巴林，用0.1%三氟乙酸稀释，再用高氯酸沉淀蛋白质。提取效率达到定量水平，与理论产率（100%）无显著差异。分析物通过串联质谱仪进行检测，选择性非常好，未检测到内源性物质或其他可能同时使用的抗癫痫药物的干扰信号。维加巴特林、加巴喷丁和普瑞巴林的校准范围分别为0.5–25 μg/mL、0.6–30 μg/mL和0.2–10 μg/mL，涵盖了这些物质在人体血浆中的治疗浓度。该方法在所有浓度水平下的精密度均优于10%，在最低检测限（LLOQ）下的准确度优于15%，在其他浓度水平下的准确度也优于10%。该方法已成功应用于我们实验室中，用于这些药物患者的常规治疗药物监测（TDM）。

引言

维加巴特林、加巴喷丁和普瑞巴林（分子结构见图1）广泛用于治疗癫痫，加巴喷丁和普瑞巴林还用于治疗神经性疼痛。这三种物质都是内源性神经递质γ-氨基丁酸（GABA）的结构类似物。口服后，它们都能被良好吸收并通过肾脏排出，几乎不发生代谢[1]、[2]。因此，它们的药代动力学特性较为可预测。然而，治疗药物监测（TDM）有助于提高加巴喷丁或普瑞巴林的治疗效果和安全性，因为这两种药物都有公认的血浆浓度参考范围（加巴喷林为3–21 μg/mL，普瑞巴林为2–6 μg/mL）[3]。维加巴林的预期浓度范围为2–10 μg/mL，而中毒浓度超过20 μg/mL[4]。尽管通常认为维加巴林不需要进行TDM，但对于肾功能受损、吸收不良或依从性存疑的患者，TDM可能有所帮助[5]。 为了支持TDM，需要具有适当选择性和灵敏度的验证分析方法。维加巴特林、加巴喷丁和普瑞巴林属于难分析的物质：它们具有极性和亲水性，使得从血浆中提取并在反相固定相上进行HPLC分离变得困难；同时，它们不含发色团，直接使用紫外检测方法的选择性很低。已有研究报道，使用反相色谱法时，这些物质的保留因子接近色谱柱的死时间[6]、[7]，或者对于维加巴林而言，几乎在死时间时没有保留[8]。因此，一些已发表的分析方法依赖于样品的预柱衍生化处理，随后通过HPLC-荧光检测（例如使用邻苯二醛（OPA）[9]或4-氯-7-硝基苯并呋喃[10]）。这些研究中的衍生化方法改善了分析物的色谱性能和检测能力，但需要使用有毒试剂，操作繁琐且耗时。Jin等人[11]提出了一种无需衍生化的方法，直接将血浆提取物注入极性固定相后进行GC–MS分析。然而，样品制备过程中需要繁琐的冷冻干燥步骤。另一种分析方法是使用极性固定相进行HPLC分离，并通过ESI-MS/MS进行检测。Oertel等人[12]描述了一种基于酰胺固定相的HILIC分离机制的方法，实现了快速简便的样品制备、良好的色谱分离以及灵敏和选择性的检测结果。但他们未使用内标，这可能导致由于样品基质效应引起的定量误差。对于极性物质而言，使用多孔石墨碳作为固定相是一种更有优势的分离方法。这种固定相具有独特的选择性，可被100%的水性缓冲液润湿，并且在碱性及酸性条件下均稳定。据我们所知，目前尚未有使用该固定相对维加巴特林、加巴喷丁和普瑞巴林进行定量分析的方法发表。因此，本研究的目的是开发并验证一种基于多孔石墨碳的分离方法，并通过ESI-MS/MS进行检测，特别关注样品制备的快速简便性，并将其引入常规TDM中。

方法片段

化学试剂

维加巴特林（纯度>98%）和加巴喷丁（纯度=98.5%）购自Sigma-Aldrich（德国陶夫基兴）。普瑞巴林（纯度>98%）和内标D₄-普瑞巴林（纯度=98%，同位素纯度>95%）购自Toronto Research Chemicals（加拿大安大略省沃恩）。根据欧盟的体外诊断法规（IVDR），为了TDM目的，我们还使用了经过认证的校准样品（产品编号MS9213，批次2472）。

样品制备

为了开发适用于TDM的方法，我们需要一种简单快速的样品制备流程。该流程仅包括加入内标、稀释和蛋白质沉淀。由于典型患者样本中分析物浓度较高，必须使用0.1%三氟乙酸进行稀释，以避免超出质谱仪的检测范围。此外，这种稀释方法使制备样品的组成接近色谱分离所需的成分。

结论

在本研究中，我们展示了在多孔石墨碳固定相上对人类血浆中的维加巴特林、加巴喷丁和普瑞巴林进行色谱分离的方法。采用这种分离机制，成功实现了这些极性和亲水性分析物的有效保留，同时将生物基质中共同提取的磷脂引起的基质效应降至最低。尽管所有分析物的验证参数均符合要求，

CRediT作者贡献声明

Jens Martens-Lobenhoffer：撰写原始稿件、进行研究、数据整理。 Stefanie M. Bode-B?ger：撰写、审稿和编辑、概念构思。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能影响本文工作的财务利益或个人关系。