《Journal of Dairy Science》：Milk metabolomic alterations correlated with intramammary infection in dairy cows: From healthy status to clinical mastitis
编辑推荐：
本研究为探寻乳腺内感染至临床型乳腺炎的渐进性病理代谢特征，研究人员系统分析了荷斯坦奶牛不同健康状态（健康、乳腺内感染、亚临床型乳腺炎、临床型乳腺炎）的乳区代谢组学谱。结果揭示了45种代谢物的变化，其中34种存在组间差异，这些变化与血乳屏障损伤、炎症、氧化应激及能量和脂质代谢等关键生物学过程密切相关。研究表明，即使在体细胞数正常范围内，乳腺感染初期已触发乳中代谢组学改变，并随着疾病进展而加剧，为深入理解乳腺炎发生机制及早期诊断提供了重要线索。
乳腺炎是奶牛养殖业面临的主要健康挑战之一，它不仅是导致乳房炎症和感染的疾病，更关联着一系列令人头疼的经济损失：从牛奶产量和品质的下降，到治疗成本增加和抗生素滥用风险，乃至影响动物福利和造成奶牛死亡。据估计，一个牛群中高达25%至60%的奶牛可能受到乳腺炎的影响。因此，深入理解乳腺炎的发病机制，对于开发更有效的防控策略至关重要。
传统的乳腺炎诊断主要依赖于体细胞数（SCC）和细菌学培养。体细胞数是反映乳腺感染和炎症程度的常用指标，通常将200,000个细胞/mL作为感染的阈值。然而，金标准的诊断方法——细菌学培养耗时较长，且部分乳腺内感染并不伴随SCC的升高，这使得早期和精准诊断面临挑战。乳腺炎根据临床表现可分为临床型（CM）和亚临床型（SCM），后者虽无肉眼可见的症状，但SCC已升高，同样对生产造成损害。此外，还有一种状态被称为“乳腺内感染”（IMI），即细菌学培养呈阳性，但SCC仍在正常范围（<200,000个细胞/mL）且无临床症状。那么，一个关键的科学问题浮现了：从健康的乳腺，到仅有细菌感染的IMI状态，再到SCC升高的SCM，直至出现明显临床症状的CM，这一疾病进程中，奶牛乳汁内部的微小分子世界——即代谢组——究竟发生了怎样的动态变化？这些变化能否为我们理解乳腺炎的渐进性发展提供新的视角？
为了解答这一问题，来自意大利帕多瓦大学的研究团队开展了一项精心设计的横断面研究，并将成果发表在《Journal of Dairy Science》上。他们的目标很明确：系统比较健康（H）、乳腺内感染（IMI）、亚临床型乳腺炎（SCM）和临床型乳腺炎（CM）这四个不同阶段奶牛乳区的乳汁代谢组学特征，以期绘制出一幅从感染起始到临床症状出现的完整代谢变化图谱。
为了开展这项研究，作者们运用了几个关键技术方法：首先，他们在意大利一个拥有1800头泌乳荷斯坦-弗里生奶牛的牧场，严格按照入选标准筛选了80个乳区样本，每个健康状态组（H, IMI, SCM, CM）各20个，构成了本研究的样本队列。其次，他们采用1H核磁共振（1H-NMR）光谱技术对乳汁样本进行了非靶向代谢组学分析，共鉴定出45种代谢物。在数据分析阶段，研究者利用线性混合模型进行统计比较，并采用稀疏偏最小二乘判别分析（sPLS-DA）和层次聚类热图进行模式识别和分组，最后通过通路分析来阐释差异代谢物所影响的生物学途径。
结果
代谢组学模式揭示了疾病的渐进性分离
通过sPLS-DA分析，研究人员发现四组奶牛的乳汁代谢组呈现出清晰的分离模式。临床型乳腺炎（CM）组的代谢组与其他三组完全分开，表明其代谢状态发生了最剧烈的改变。亚临床型乳腺炎（SCM）组与健康（H）组能够区分，但与乳腺内感染（IMI）组存在部分重叠。而IMI组与H组之间也呈现出部分分离，且代谢组分布范围更广。这些结果直观地表明，乳汁代谢组的变化与乳腺疾病的严重程度密切相关，并且这种变化在感染早期（IMI）就已初现端倪。
层次聚类与通路分析指向核心生物学过程
对所有鉴定出的45种代谢物进行层次聚类热图分析，进一步确认了CM组代谢谱的独特性。代谢物被聚为几个亚簇，反映了不同的变化模式。基于这些亚簇的通路分析显示，随着疾病进展，特别是到CM阶段，涉及甘油磷脂代谢、半乳糖代谢、柠檬酸循环（TCA循环）以及甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢等通路的活动发生了显著改变。同时，在CM组中，糖酵解/糖异生和丙酮酸代谢通路则表现出更高的活性。这些发现将乳汁代谢物的变化与炎症、能量代谢重组和细胞膜完整性破坏等关键病理生理过程联系了起来。
关键代谢物的渐进性变化
在鉴定出的45种代谢物中，有34种在不同组间存在显著差异。尤为重要的是，其中18种代谢物呈现出从H到CM的渐进性变化趋势。这些代谢物包括：
- •
乳糖：浓度从H到CM显著且进行性下降。乳糖是维持乳汁渗透压的关键成分，其减少是血乳屏障受损的标志，表明炎症导致血液成分渗入乳汁。
- •
乳酸、丙酮酸、丙氨酸（Ala）、乙酸：这些与能量代谢相关的代谢物在CM组中浓度显著升高。乳酸和丙酮酸的增加可能反映了无氧糖酵解的增强以及细菌代谢活动的活跃。
- •
2-氨基己二酸、N-乙酰甘氨酸（N-acetyl-Gly）、二甲基胺：这些代谢物在感染组中升高，可能与微生物的氮代谢活动有关。
- •
肉碱、顺式-乌头酸（cis-aconitate）、延胡索酸、磷酸肌酸、乳清酸**：这些参与能量代谢（如脂肪酸β-氧化、TCA循环）和细胞能量储备的代谢物，在SCM和CM组中浓度降低，暗示全身或局部能量状态的耗竭以及TCA循环功能可能受损。
- •
磷酸胆碱、胞磷胆碱（citicoline）：作为细胞膜磷脂代谢的组成部分，它们在CM组中减少，可能反映了乳腺上皮细胞膜的损伤。
此外，还有12种代谢物（如亮氨酸、缬氨酸、牛磺酸、3-羟基丁酸等）仅在CM组中与其他组表现出差异，凸显了临床阶段代谢紊乱的独特性和严重性。
讨论与结论
本研究的深入讨论将上述代谢变化置于具体的生物学背景下进行阐释，揭示了乳腺炎从感染到临床表现的动态进程中，乳汁微环境所发生的复杂重构。
首先，研究证实了血乳屏障损伤的存在。乳糖的进行性减少是核心证据，这与炎症导致的乳腺上皮细胞间连接破坏、血液成分流入乳汁有关。同时，N-乙酰葡糖胺（与溶酶体酶NAGase活性相关）在CM组的减少，以及5-十二碳烯酸（一种具有潜在抗炎活性的氧化脂质）在CM组的特异性升高，都进一步支持了CM阶段存在更严重的炎症和组织损伤。
其次，研究揭示了乳腺感染本身对代谢组的直接影响。即使在SCC正常的IMI阶段，一些与微生物代谢相关的代谢物已发生变化。例如，乳清酸（维生素B13）的减少可能是细菌将其作为氮源消耗的结果。二甲基胺和N-乙酰甘氨酸的变化也与微生物的氮代谢活动有关。在CM阶段，麦芽糖、阿拉伯糖的减少可能与病原体（如大肠杆菌、链球菌等）利用这些糖类作为碳源有关，而甲酸浓度的升高可能源于细菌发酵活动或炎症导致的血液甲酸渗入。
第三，研究系统描绘了能量代谢的重编程。从H到CM，乳汁葡萄糖呈现进行性下降，而半乳糖和核糖的减少仅发生在CM组，这可能分别反映了免疫细胞和病原体对能量的竞争性消耗，以及核苷酸合成和修复需求的增加。更显著的是，乳酸、丙酮酸、Ala和乙酸的升高，以及顺式-乌头酸、延胡索酸、2-酮丁酸和磷酸肌酸的降低，共同指向了一个代谢转变：糖酵解和丙酮酸代谢增强，而TCA循环效率可能降低。这种“有氧糖酵解”模式在快速增殖的免疫细胞和某些病原体中很常见，反映了感染病灶的高能量需求和可能的缺氧环境。磷酸肌酸的减少则可能暗示了全身性能量储备的消耗。
第四，研究指出了脂质代谢的紊乱。涉及胆碱代谢的化合物（磷酸胆碱、胞磷胆碱、sn-甘油-3-磷酸胆碱）在IMI和SCM组的变化模式（磷酸胆碱减少，甘油磷酸胆碱增加）可能反映了感染初期与细胞增殖和膜重构相关的代谢适应。而在CM组，这些代谢物的普遍减少则可能与细胞膜的大规模损伤有关。肉碱的进行性下降也提示脂肪酸β-氧化过程可能受到影响。
综上所述，这项研究得出了明确的结论：奶牛乳汁的代谢组学改变在乳腺被感染但体细胞数尚处于正常范围（即IMI阶段）时就已经开始发生，并随着疾病进展至亚临床型和临床型乳腺炎而逐步加剧和复杂化。这些变化并非孤立事件，而是与血乳屏障损伤、炎症反应、氧化应激、宿主与病原体的能量代谢竞争、脂质代谢紊乱以及微生物的直接代谢活动等多个相互关联的生物学过程紧密交织在一起。
这项研究的重要意义在于：它首次系统性地比较了从健康、隐性感染到显性乳腺炎这一连续谱系中的乳汁代谢组，为理解乳腺炎的病理生理发展提供了动态的、分子层面的全景视角。研究所识别出的特征性代谢物，特别是那些在疾病早期（IMI）即发生变化的分子，具有成为潜在早期诊断生物标志物的价值，有望弥补当前仅依靠SCC和细菌培养在诊断时效性和灵敏度上的不足。此外，这些代谢通路和关键节点的揭示，也为未来开发针对乳腺炎特定代谢环节的新型干预策略（如营养调控或代谢调节剂）提供了重要的理论依据和潜在靶点。
