叶酸受体靶向的斑蝥素和紫杉孢霉素双药纳米脂质体，用于肝细胞癌的多靶点协同治疗

《Journal of Drug Delivery Science and Technology》：Folate receptor-targeted cantharidin and staurosporine dual-drug nanoliposomes for multi-target synergistic therapy in hepatocellular carcinoma

肝癌靶向纳米脂体协同抑制mTOR/HIF-1α/VEGF通路及免疫微环境调控研究。

　　

钟子怡|魏爱秋|张一鸣|何金城|庞海和|夏新华|张小青

湖南中医药大学药学院，中国湖南长沙410208

摘要

由于肝细胞癌（HCC）具有复杂的信号通路和高异质性，其对单药治疗的反应有限。因此，联合疗法是改善HCC治疗的一种有前景的策略。本研究构建了叶酸（FA）修饰的斑蝥素（CTD）和星孢素（STS）共载的靶向纳米脂质体（FA/CTD-STS/NLP），用于HCC的多靶点协同治疗。通过Chou-Talalay方法确定CTD: STS的最佳质量比为588:1，并采用薄膜分散和嵌入技术制备了DSPE-PEG2000-FA功能化的纳米脂质体。制备的FA/CTD-STS/NLP具有球形形态，粒径为116.4 nm，粒径分布指数（PDI）为0.228，包封效率较高（CTD为90.1%，STS为93.4%），并且在储存和血清中具有良好的稳定性。体外研究表明，FA/CTD-STS/NLP通过叶酸受体（FR）介导的内吞作用进入H22细胞，显著抑制细胞增殖并促进细胞凋亡。在H22肿瘤小鼠模型中，即使剂量降低，FA/CTD-STS/NLP也表现出增强的肿瘤积聚效果，肿瘤抑制率为83.24%，同时全身毒性最小。机制研究表明，FA/CTD-STS/NLP通过协同抑制mTOR/HIF-1α/VEGF信号通路中的关键靶蛋白，增加Bax/Bcl-2比率以激活线粒体凋亡通路，并上调肿瘤组织中的CD4和CD8表达，表明其具有潜在的免疫调节作用。本研究首次开发了FA/CTD-STS/NLP共递送系统，通过优化的药物组合比实现了高效的肿瘤靶向递送。它协调调节了mTOR/HIF-1α/VEGF信号通路和肿瘤免疫微环境，为高效且低毒性的HCC治疗提供了新策略。

引言

肝细胞癌（HCC）是最常见的原发性癌症之一，目前是全球第六大常见肿瘤和第三大癌症相关死亡原因。其发病率和死亡率持续上升[1]，[2]。目前，HCC的治疗主要包括传统手术、放疗、化疗、单靶点治疗和免疫治疗[3]，[4]。然而，这些治疗方法面临严重的副作用、单靶点治疗易产生耐药性以及患者反应率低等问题[5]，[6]。因此，迫切需要开发一种纳米靶向药物组合制剂来提高HCC的治疗效果。

斑蝥（Mylabris）是中国芫菁的干燥体。用于医学的物种包括Mylabris phalerata Pallas和Mylabris cichorii Linnaeus。作为一种有超过2000年使用记录的传统中药，斑蝥具有解毒、消疮、化瘀和散结的作用[7]。从斑蝥中提取的萜类化合物斑蝥素（CTD）是其主要活性成分。现代研究表明，CTD可以增加白细胞计数并增强免疫功能[8]，[9]，并对肝细胞癌和肺癌等恶性肿瘤具有多靶点、多途径和多机制的独特治疗效果[10]，[11]，[12]，[13]。CTD通过下调HepG2细胞中的EphB4来抑制PI3K/Akt通路，从而抑制mTOR活性。这种mTOR活性的降低减少了肝细胞癌细胞的生长并促进了细胞凋亡[14]。研究发现，EphB4在多种常见癌症中过度表达，包括肝细胞癌，其中它阻断PI3K/Akt信号通路。这种阻断导致ERK的激活、VEGF的上调以及肿瘤血管生成的促进[15]，[16]。总之，CTD可以抑制肿瘤血管生成、肿瘤细胞增殖和转移，并诱导癌细胞凋亡，显示出显著的抗肿瘤效果[17]，[18]，[19]，[20]。然而，游离CTD的溶解度差、生物利用度低和副作用大严重限制了其临床应用。因此，将CTD封装在药物递送系统中可能增强其在肿瘤部位的积累并提高CTD的治疗效果。

星孢素（STS）是一种蛋白激酶C（PKC）抑制剂，是从链霉菌中分离出的具有双吲哚结构的生物碱，对肝细胞癌、乳腺癌、肾细胞癌和结肠癌具有强大的抗癌效果[21]，[22]，[23]，[24]。STS可以直接抑制mTOR激酶活性，干扰mTOR信号通路，通过多种信号通路抑制VEGF表达，从而抑制肿瘤增殖和血管生成[25]，[26]，[27]。STS通过抑制核因子-κB（NF-κB）、缺氧诱导因子（HIF-1α）和周期依赖性激酶（CDKs）等转录因子来减少VEGF表达[28]，[29]，[30]，[31]。血管内皮生长因子（VEGF）是促进肝细胞癌新生血管生成、生长和转移的重要免疫抑制因子。缺氧通过促进VEGF的产生和诱导HIF-1α的激活来促进肿瘤血管生成[32]，[33]，[34]。针对VEGF及其受体的靶向治疗可以减少肿瘤内的新生血管生成，从而抑制肿瘤增殖、侵袭和转移[35]，[36]，[37]，[38]。然而，在临床环境中，接受单靶点VEGF药物治疗的患者经常出现原发性或继发性耐药性[39]，激活替代信号通路是耐药性的关键原因[40]。值得注意的是，STS的临床应用受到其固有局限性的严重阻碍，如溶解度差和靶向能力不足。因此，为了克服CTD和STS共同的溶解度差、缺乏靶向性和全身毒性问题，并实现它们的共递送，开发一种高效的纳米载体系统至关重要。脂质体因其出色的生物相容性、能够封装亲水性和疏水性药物以及易于表面功能化而成为理想的递送系统，旨在通过多种途径协同抑制关键靶蛋白。这种策略有望提高肿瘤细胞的药物敏感性，实现协同治疗效果，并降低毒性，从而提高HCC的治疗效果。

一种先进的靶向纳米载体系统用于药物递送，将细胞内化与增强的渗透性和滞留（EPR）效应结合起来，促进药物在肿瘤组织中的积累和滞留，从而提高治疗效果，同时将对正常组织的毒性降到最低。通过将肿瘤特异性配体结合到纳米颗粒表面，优化颗粒大小和表面性质以最大化EPR效应，并通过化学修饰纳米材料表面来控制药物释放动力学，可以显著改善治疗效果[41]，[42]。在本研究中，我们使用脂质体作为多功能载体，并通过薄膜分散和嵌入方法将DSPE-PEG₂₀₀₀-FA引入脂质体结构，制备了叶酸（FA）修饰的CTD和STS共载的靶向纳米脂质体递送系统（FA/CTD-STS/NLP）。叶酸可以特异性结合到肿瘤细胞表面高度表达的FR上[43]，[44]，[45]，并可以结合到脂质体表面以精确靶向肝细胞癌细胞。此外，叶酸可能调节肿瘤微环境（TME）中的免疫细胞功能。具体来说，研究表明叶酸可以通过调节T细胞和B细胞的功能来影响抗肿瘤免疫反应[46]，[47]。因此，本研究首次提出了叶酸（FA）修饰的CTD和STS共载的靶向纳米脂质体（FA/CTD-STS/NLP）的构建。该设计将传统中药的多靶点治疗概念与现代高选择性蛋白激酶抑制策略相结合，旨在通过多途径调节实现mTOR/HIF-1α/VEGF等关键靶点的协同抑制。它为实现高效且低毒性的HCC治疗提供了新的策略和实验基础。

试剂

斑蝥素从武汉新新佳利生物科技有限公司（中国武汉）获得。星孢素从上海源叶生物科技有限公司（中国上海）购买。大豆磷脂（SPC）和硬脂酰磷脂乙醇胺-聚乙二醇2000（DSPE-PEG₂₀₀₀）从德国Lipoid公司购买。胆固醇（Chol）从上海新华药业集团化学试剂有限公司（中国上海）购买。

CTD和STS的协同效应

本研究采用了最广泛使用的抗肿瘤药物组合评估方法之一——Chou-Talalay方法，并使用CompuSyn软件进行分析。该方法通过计算CI来量化药物相互作用：CI < 1表示协同作用，CI = 1表示加性作用，CI > 1表示拮抗作用[48]，[49]。CTD和STS的IC₅₀值分别为（0.688 ± 0.100）μg/mL和（0.605 ± 0.06）ng/mL。根据IC₅₀值设置了不同的比例进行研究

结论

总之，我们开发了一种协同共递送纳米靶向策略，将传统中药（TCM）中的活性成分与蛋白激酶抑制剂结合。FA/CTD-STS/NLP系统封装了两种具有协同作用的治疗药物，同时通过嵌入方法将DSPE-PEG2000-FA功能化到纳米载体药物递送系统上，用于靶向HCC治疗。FA/CTD-STS/NLP具有球形形态，粒径为116.4 ± 0.2 nm

CRediT作者贡献声明

魏爱秋：方法学、研究、数据管理。张一鸣：方法学、研究、数据管理。何金城：研究、数据分析。庞海和：研究、数据分析。钟子怡：撰写——初稿、方法学、研究、数据分析、概念化。张小青：撰写——审稿与编辑、监督、资源获取、研究、资金获取、数据分析、概念化。夏新华：撰写——审稿与编辑

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。

数据可用性

数据可根据请求提供。

利益冲突声明

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致谢

本研究得到了湖南省自然科学基金（编号：2023JJ50286）和湖南省教育厅的科学研究基金（编号：21A0255）的支持，以及湖南中医药大学的中药药理学重点学科项目（编号：202302）的支持。