《Journal of Ethnopharmacology》：Yinhuo Decoction attenuates depression-like behaviors and promotes M2 microglia polarization by regulating PI3K/Akt/NF-κB signaling pathway in a murine model of menopausal depression
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更年期抑郁症小鼠模型中益母饮通过调节小胶质细胞极化影响PI3K/Akt/NF-κB通路发挥抗神经炎症作用。
张月|雷霞|薛敖|赵德平|艾豪|周宇|王文文|张宁|耿芳|徐洪丹
中国江苏省徐州市徐州生物工程职业学院药学与食品学院，邮编221006
摘要
民族药理学相关性
养阴补肾的经典中药方剂“银荷煎”（YHD）传统上用于治疗抑郁症和女性更年期综合征，并显示出对绝经后抑郁症（MD）的治疗潜力。尽管现代药理学研究证实了其强大的抗炎作用，但YHD在调节小胶质细胞极化中的作用及其关键活性成分仍不明确。研究目的
本研究旨在确定YHD中具有抗神经炎症作用的关键活性成分和分子靶点，并阐明其作用机制。材料与方法
建立了卵巢切除术（OVX）+慢性不可预测轻度应激（CUMS）诱导的绝经后抑郁症小鼠模型。小鼠被随机分为六组（每组15只）：假手术组、OVX+CUMS组、E2组（0.13 mg/kg）和YHD组（11.7、23.4、46.8 g/kg）。使用UHPLC-LTQ-Orbitrap MS对脑脊液中的YHD成分进行定性分析，并结合网络药理学方法筛选其抗神经炎症作用的核心成分和靶点。通过分子对接、细胞热位移测定（CETSA）以及亲和超滤技术分析了YHD成分与关键靶点之间的相互作用。还在LPS+ATP诱导的细胞模型中探讨了YHD活性成分的治疗效果。结果
YHD治疗显著缓解了OVX+CUMS小鼠的抑郁样行为，调节了小胶质细胞的M1/M2表型平衡并减少了神经炎症。脑脊液的化学分析鉴定了7种YHD衍生物成分，网络药理学分析提示PI3K/Akt/NF-κB信号通路是关键的作用机制。这一预测在体内得到了验证。在LPS+ATP刺激的BV2小胶质细胞中，包括紫锥菊苷、五味子素B和Verbascoside在内的核心单体成分再现了体内的调节作用。分子对接、细胞热位移测定（CETSA）和亲和超滤研究进一步证明这三种化合物均能与PI3K直接结合，其中Verbascoside的亲和力最高。此外，PI3K抑制剂LY294002能够逆转PI3K/Akt通路的激活以及Verbascoside对NF-κB信号的抑制作用。结论
本研究结果表明，YHD可促进OVX+CUMS小鼠的小胶质细胞从M1极化为M2极化，其作用机制涉及PI3K/Akt/NF-κB通路。引言
绝经后抑郁症（MD）是一种全球范围内常见的情绪障碍，表现为频繁的悲伤情绪、睡眠障碍、饮食失调、快感缺失、焦虑、绝望等异常行为，是人类健康的主要风险因素（Jia等人，2024年；Fidecicchi等人，2024年）。女性患抑郁症的风险是男性的2到3倍，在雌激素水平下降期间（如围绝经期和绝经后）风险更高（Albert和Newhouse，2019年；Li等人，2023年）。目前临床实践中缺乏针对MD的特异性治疗方法。传统治疗策略主要依赖于基于雌激素的激素疗法和/或口服抗抑郁药（如SSRIs），通常单独使用或联合使用（Herson和Kulkarni，2022年；Fait，2019年）。然而，长期使用这些干预措施存在显著的安全问题，包括心血管疾病风险增加、子宫内膜异常以及激素依赖性恶性肿瘤（如乳腺癌）的风险。迫切需要寻找低毒性和高效的抗MD药物，草药疗法可能在这方面具有潜力。
关于抑郁症的发病机制提出了多种假说，包括单胺假说、神经炎症和氧化损伤假说、HPA轴异常假说以及神经发生假说（Liang等人，2024年）。越来越多的证据表明，免疫炎症通路的异常参与了重度抑郁症（MDD）的病理生理过程，MDD患者体内可能存在高水平的促炎细胞因子和C反应蛋白（K?hler等人，2018年）。小胶质细胞作为大脑中的常驻巨噬细胞，在保护神经元和防止中枢神经系统（CNS）释放有毒介质方面起着关键作用。慢性不可预测的应激会导致小胶质细胞稳态失衡，这是抑郁症的一个促成因素（Jia等人，2021年；Wang等人，2022a；Wang等人，2022b）。小胶质细胞介导的神经炎症在抑郁症的发展中起重要作用，使这些细胞成为有前景的治疗靶点（Kabba等人，2018年；Zhong等人，2024年）。与外周巨噬细胞类似，小胶质细胞通过改变其表型和功能来应对CNS环境干扰以维持稳态。经典激活型（M1样）小胶质细胞释放促炎因子（如TNF-α和IL-1β）以对抗病原体。相反，替代激活型（M2样）小胶质细胞促进组织修复和再生，通过释放Arg-1、IL-10等因子发挥神经保护作用。研究表明，抑郁大鼠的海马区M1小胶质细胞增加，而M2小胶质细胞减少。促进小胶质细胞向M2极化可以缓解卵巢切除术（OVX）和慢性应激引起的抑郁样行为（Gu等人，2020年；Hao-Ran等人，2020年）。绝经期间雌激素水平的下降会导致PI3K/Akt通路抑制，进而导致NF-κB通路异常激活。其过度激活会使小胶质细胞向促炎型M1表型极化，释放大量促炎因子（如IL-1β、IL-6和TNF-α），从而加剧神经组织损伤和抑郁样行为（Wu等人，2020年）。因此，调节小胶质细胞极化并减少相关神经炎症已成为治疗MD的重要策略。
近年来，中医在抑郁症治疗中显示出独特优势，其特点是成分多样、多靶点作用、多机制效应、副作用少、协同性强以及整体调节作用。因此，中医有望成为治疗抑郁症的有效且安全的选择。YHD由清代著名医生陈世铎记载，首次出现在《奇效医方录·卷三·喉门》中的“辨症录”。该方由rehmannia glutinosa（Gaertn.）DC.（中文名：熟地）、morinda officinalis F.C. How（中文名：八珍汤）、poria cocos（Schw.）Wolf（中文名：茯苓）、ophiopogon japonicus（Thunb.）Ker Gawl.（中文名：麦冬）和schisandra chinensis（Turcz.）Baill.（中文名：五味子）组成（Zhang等人，2018年）。临床实践中，它被广泛用于治疗抑郁症、焦虑症、失眠和女性更年期综合征，尤其在改善绝经后女性的记忆力减退、调节情绪失衡等方面取得了理想效果（Duan等人，2018年；Ji等人，2021年；Ji等人，2021年；Chen等人，2021年）。临床前研究发现YHD具有良好的抗抑郁和神经保护作用。目前，已从YHD中分离并鉴定出多种生物活性化合物，如木脂素、黄酮类和环烯醚萜类，它们具有良好的抗抑郁作用。例如，catalpol通过抑制NF-κB通路中的NLRP3炎性体来缓解抑郁（Liang等人，2023年）。同样，五味子素降低了抑郁小鼠的促炎因子水平并抑制了海马区NF-κB信号通路的表达（Sun等人，2020年）。我们之前的研究表明，YHD在绝经后抑郁症小鼠模型中具有抗抑郁作用。这种作用与海马区小胶质细胞过度激活的抑制有关，表现为小胶质细胞标记物Iba-1及促炎细胞因子TNF-α和IL-1β的表达降低（Zhang等人，2024a；Zhang等人，2024b）。然而，YHD促进M1向M2型小胶质细胞极化的精确分子机制及其关键活性成分尚不完全清楚。先前的研究表明，环烯醚萜类和木脂素可能通过增强PI3K/Akt磷酸化来抑制NF-κB的激活，从而减少IL-1β和IL-6等促炎因子的表达（Lin等人，2024年；Wang等人，2022a；Wang等人，2022b；Fu等人，2022年；Yan等人，2019年；Song等人，2020年；Hong等人，2023年）。鉴于YHD中环烯醚萜类的丰富含量，我们推测其抗神经炎症作用与PI3K/Akt信号通路的调节密切相关。因此，确定PI3K/Akt通路在YHD作用中的核心调节作用对于阐明该方剂的药效学基础和作用机制至关重要。
本研究采用UPLC-MS/MS分析了YHD的主要化学成分，作为质量控制标准。在OVX+CUMS小鼠中评估了YHD的神经保护作用及其对小胶质细胞M2极化的影响。使用UHPLC-LTQ-Orbitrap MS分析了YHD的脑脊液成分，并通过网络药理学进一步研究。GO和KEGG富集分析确定了关键的相关生物过程和信号通路。随后的体内实验验证了网络药理学预测，并使用细胞模型筛选了活性成分并阐明了其作用机制。我们的研究证实了PI3K-AKT/NF-κB通路与MD之间的关联，同时筛选并评估了MD发病和发展的新靶点。这些发现提高了我们对MD机制和治疗方式的理解，为寻找多靶点和多通路治疗方法提供了新的思路。结果表明，YHD可促进OVX+CUMS小鼠的小胶质细胞从M1极化为M2极化，其作用机制涉及PI3K/Akt/NF-κB通路。
YHD的制备与质量控制
YHD由五种草药成分组成：rehmannia glutinosa（Gaertn.）DC.（15克）、morinda officinalis F.C. How（10克）、ophiopogon japonicus（Thunb.）Ker Gawl（10克）、poria cocos（Schw.）Wolf（5克）和schisandra chinensis（Turcz.）Baill.（5克）。这些中药颗粒均来自中国哈尔滨的北京同仁堂，由黑龙江中医药大学陈小忠教授鉴定。测试草药的标本已存入标本馆。
YHD中关键成分的定量
为确保YHD的质量控制，采用UPLC-MS/MS分析了样品。该方法根据FDA的生物分析方法验证（BMV）指南进行了验证，包括线性、精度、准确性和稳定性。对六个YHD样品进行了日内和日间精度和准确性评估，两组数据均在可接受范围内（见表3）。稳定性通过计算相对值进行评估。讨论
最近的研究提出，抑郁症可以被视为一种涉及小胶质细胞失调的疾病。根据抑郁患者小胶质细胞的激活状态，可以在个性化医疗框架内开发针对性的治疗策略，例如使用小胶质细胞抑制剂或刺激剂（Yirmiya等人，2015年；Eyo和Wu，2019年；Yao等人，2022年；Guo等人，2022年）。抑郁症在女性中更为常见，而绝经期被认为是关键因素。结论
总之，本研究证明了YHD在改善OVX+CUMS小鼠的抑郁样行为和抗神经炎症反应方面的有效性，从行为、组织形态学和分子生物学的角度进行了验证。基于脑脊液中YHD的成分，通过网络药理学预测了作用机制，并在体内和体外实验中得到了验证。关键成分与靶点之间的相互作用通过分子对接和细胞热位移测定进行了验证。CRediT作者贡献声明
艾豪：软件处理、数据分析。赵德平：概念构思。薛敖：初稿撰写、可视化。雷霞：初稿撰写、资金获取。张宁：撰写、审稿与编辑、方法学设计、资金获取、数据分析。耿芳：撰写、审稿与编辑。王文文：数据管理。周宇：概念构思。张月：撰写、审稿与编辑。徐洪丹：撰写、审稿与编辑未引用参考文献
Zhang等人，2018年；Duan等人，2018年；Chen等人，2014年；Li等人，2023年；Lin等人，2024年。
数据与材料的可用性
研究中提供的原始数据包含在文章中，如需进一步信息，请联系相应作者。
伦理批准与参与同意
所有动物实验均获得了黑龙江中医药大学动物护理与使用委员会的批准。
利益冲突声明
作者声明没有利益冲突。
资助
国家自然科学基金（普通项目，82474101）；江苏省
CM退行性骨与关节疾病临床创新中心（20210405）；中央政府支持地方高校改革与发展资金（关于二枝丸在
AD预防和治疗中的机制研究）；无锡
卫生委员会青年和中年人才
支持计划（BJ2023094）；
国家自然科学基金（普通项目）
利益冲突声明
作者声明没有已知的利益冲突或可能影响本文工作的个人关系。
