高频超声波（厚度振动模式）诱导的细胞内活性氧生成：一项突破传统认知的研究

《Advanced Science》：Intracellular Reactive Oxygen Species Generation Induced by High-Frequency Ultrasound in Thickness Vibration Mode

本研究挑战了“高频超声波（>5 MHz）因难以诱发空化而无法有效产生活性氧（ROS）”的传统观点。通过对比6.5 MHz高频与1 MHz常规频率超声波对溶液及细胞内ROS生成的影响，发现由铌酸锂（LN）换能器产生的高频超声波能更有效地在细胞内生成ROS。这一现象得益于其细胞尺寸波长（λ/4 < 50 μm）所带来的高空间分辨率，揭示了高频超声在细胞层面精准诱导ROS、具有应用于新型疗法（如肿瘤治疗）的巨大潜力。

　　

引言：挑战传统认知的高频超声波

活性氧（ROS）是细胞信号通路中的关键分子，参与代谢、衰老和细胞死亡等过程。超声波辐照液体时产生的空化效应能通过高温热解水分子生成ROS（如•OH），这一现象在声动力或声化学应用中常被利用。传统研究普遍认为，适用于ROS生成的空化在频率高于约1 MHz时难以发生，因为频率越高，振幅越小，气泡尺寸越小，其生长和塌缩越不可能。因此，以往关于超声诱导ROS生成的研究主要集中于低于1.0 MHz的频率。然而，本研究提出了一个根本性问题：高频超声波真的不影响细胞内的ROS生成吗？

为了探究这个问题，研究团队提出直接比较高频（6.5 MHz）与常规医疗超声频率（1 MHz）对溶液及细胞内ROS生成的影响，旨在阐明高频超声波在细胞层面生成ROS的能力。

结果

1. 超声辐照装置（USID）的制备

为了向细胞辐照高频超声波，研究团队制造了一种超声辐照装置（USID），其核心是使用厚度振动模式的铌酸锂（LN）换能器来产生ROS。作为对比，制备了发射1.0 MHz超声波的锆钛酸铅（PZT）换能器。阻抗分析仪测量确定，PZT和LN在厚度振动模式下的共振频率分别为1.0 MHz和6.5 MHz，其中6.5 MHz约等于细胞尺寸的四分之一波长。装置将换能器夹在电极板和探针电极之间，通过施加电流激活，并将玻璃底培养皿固定以确保辐照位置和距离恒定。

声压分布测量显示，LN和PZT换能器均形成了中心声压最大的山形分布，但LN换能器由于频率增高导致的衰减增加，其声压分布更尖锐。声压与输入电流呈线性关系。

2. 超声辐照在溶液中生成ROS的评估

使用对苯二甲酸二钠（NaTA）测量液体中（即细胞外）ROS的生成量。在1.0 MHz和6.5 MHz下，荧光强度均随声压（0至2.5 MPa）和辐照时间（0至20分钟）的增加而增加。然而，1 MHz超声波诱导的ROS生成量远高于6.5 MHz，这与传统认知一致，即低频更易引发空化从而生成更多ROS。值得注意的是，即使在6.5 MHz下，当声压超过2 MPa时，也能观察到少量ROS生成。

为了确认观察到的信号确由超声诱导的ROS所致，研究使用了ROS荧光探针OxiORANGE（可特异性与•OH反应）以及ROS清除剂N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）和除气溶液进行验证。实验发现，1.0 MHz和6.5 MHz超声辐照均能引起OxiORANGE荧光强度升高，而加入NAC或使用除气溶液则能显著抑制此现象，证实了荧光增强源于超声产生的ROS（特别是•OH），而非染料自身分解或热效应。Oxi, in supernatant after ultrasonic irradiation. (b, c) Suppression of ROS generation by ROS scavenger, N-acetyl-L-cysteine (NAC), and degassing at (b) 1 MHz and (c) 6.5 MHz.">

3. 超声辐照诱导细胞内生成ROS的评估

关键发现出现在细胞内ROS的测量中。研究使用OxiORANGE探针评估了不同声压和频率下细胞内•OH的生成。

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  声压的影响（6.5 MHz）：在6.5 MHz辐照下，细胞内OxiORANGE的荧光强度变化（ΔI₅₇₇）随声压（0， 1， 2 MPa）增加而显著增加，尤其在2 MPa时最强，表明细胞内•OH的生成对声压有依赖性。
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  氧化应激条件的验证：实验设置了对照条件（0 MHz）、6.5 MHz超声、6.5 MHz超声+NAC以及热控制（加热至超声引起的温升温度）。结果表明，仅6.5 MHz超声条件能显著增加荧光强度，而加入NAC或仅加热则无此效果，证明荧光增强源于超声诱导的氧化应激，而非热效应。
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  频率的影响：在固定声压（2 MPa）下比较不同频率（0， 1.0， 6.5 MHz）对细胞内•OH生成的影响。与溶液中的结果相反，6.5 MHz超声在细胞内产生的•OH显著多于1.0 MHz超声。1.0 MHz超声在细胞内未能引起明显的•OH增加。

4. 超声诱导细胞内•OH链式反应的评估

为了探究超声产生的•OH是否在细胞内引发下游反应，研究使用了基因编码的荧光传感器HyPer7来检测过氧化氢（H₂O₂）的生成。H₂O₂是•OH反应的下游产物之一，性质相对稳定。

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  声压的影响（6.5 MHz）：在6.5 MHz下，HyPer7的荧光强度比（ΔI₄₈₀/ΔI₄₀₀）随声压（0， 1， 2 MPa）增加而增加，表明细胞内H₂O₂的生成。但与OxiORANGE信号快速上升不同，HyPer7的信号随时间逐渐增加，提示存在从•OH到H₂O₂转化的时间延迟。
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  频率的影响：在固定声压（2 MPa）下，比较不同频率对H₂O₂生成的影响。有趣的是，1 MHz超声条件诱导的细胞内H₂O₂生成量显著高于6.5 MHz。研究者分析认为，这可能是因为1 MHz超声在细胞外溶液中产生了大量•OH，这些•OH随后转化为H₂O₂。由于H₂O₂膜渗透性高，能从细胞外扩散进入细胞内，从而被HyPer7检测到。而6.5 MHz超声则主要在细胞内原位生成•OH。

5. 超声辐照诱导细胞死亡的评估

为了评估超声辐照对细胞存活的影响，研究测量了辐照后不同时间点的细胞死亡率。结果显示，在超声辐照（1 MHz和6.5 MHz， 2 MPa， 5分钟）后立即检测，所有条件下的细胞死亡率均与对照组（0 MHz）无显著差异，说明超声的机械或热效应未立即造成细胞破坏。然而，在孵育6小时和24小时后，6.5 MHz超声辐照条件下的细胞死亡率显著上升，尤其是在孵育6小时时变化最大。这表明6.5 MHz超声通过诱导ROS生成了足以引发细胞凋亡的氧化应激。

6. 三维组织中细胞内ROS的评估

为了在更接近体内环境的模型中进行验证，研究在HeLa细胞形成的球状体（Spheroid）中评估了高频超声诱导的ROS生成。球状体经OxiORANGE染色后，在不同条件下进行超声辐照。结果表明，仅6.5 MHz超声条件能引起球状体荧光强度的显著变化，且变化从球状体底部开始向内部延伸。而1 MHz超声辐照或使用NAC清除剂则未观察到明显变化。这证实了高频超声在组织水平也能有效诱导ROS生成。

讨论

本研究测量了6.5 MHz高频超声在溶液和细胞内生成ROS的情况。结果明确显示，与传统频率（≤1.0 MHz）相比，6.5 MHz高频超声在细胞内能更有效地生成•OH。这一颠覆性发现得益于采用了厚度振动模式的LN换能器，实现了高频（细胞尺寸波长）与高功率输出的结合。

关于作用机制，研究者提出了几种可能：

1. 1.
   近距离高效辐照：高频超声波长更短（λ/4 < 50 μm），更易在培养皿底部附近形成空化气泡，从而近距离刺激位于底部的细胞，减少了频率依赖性衰减的影响。
2. 2.
   非空化效应：高频超声可能通过稳定空化、声流和机械刺激（如剪切应力）间接作用于细胞。机械刺激可激活细胞内细胞器（如内质网、线粒体）的机械感受器，引起细胞内钙离子（Ca²⁺）浓度升高，进而促进线粒体ROS的生成。
3. 3.
   ROS特性差异：•OH活性极高、寿命极短，只有在细胞附近产生时才能被OxiORANGE有效捕获。6.5 MHz超声可能在细胞附近原位产生了•OH。而1 MHz超声在溶液中产生的大量•OH，在转化为H₂O₂后，凭借其稳定性和高膜渗透性进入细胞，从而被HyPer7检测到。

高频超声诱导细胞内ROS生成的特性——即抑制细胞外ROS生成，同时促进细胞内ROS生成——有望减少对靶细胞周围组织的损伤。结合其高空间分辨率（波长与细胞尺寸相当），该方法在实现低侵入性、高选择性的超声肿瘤治疗（如声动力疗法）方面具有巨大潜力。未来的研究方向包括通过技术（如像传统高强度聚焦超声HIFU那样）会聚6.5 MHz超声波，以进一步提高其选择性和治疗效果。

结论

总而言之，通过比较不同频率超声波对细胞内及溶液中ROS生成的影响，本研究发现，采用LN换能器产生的细胞尺寸级别的高频超声波辐照，相较于传统频率，能够在细胞内生成更多的ROS。利用多种荧光指示剂和传感器对ROS链式反应的部分测量，进一步验证了该现象。这项研究揭示的高频超声诱导细胞内ROS生成的新机制，为基于ROS的高频超声创新疗法（如精准肿瘤治疗）的应用铺平了道路。