《Advanced Science》：Cuproptosis and Disulfidptosis Converge to Empower PD-L1 Checkpoint Therapy via Cadict-Induced PD-L1 Translation
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本文介绍了一种新型靶向纳米药物“Cadict”，它通过铜-硫配位化学同步诱导铜死亡和二硫死亡，这两种细胞死亡方式不仅直接杀伤肿瘤细胞，还意外激活了整合应激反应，以Eif5b依赖的方式上调PD-L1表达，从而增强了肿瘤对抗PD-L1（αPD-L1）免疫检查点阻断（ICB）治疗的敏感性。该研究为克服PD-L1低表达肿瘤的ICB耐药性提供了一种创新的“先敏化后阻断”治疗范式。
引言
免疫检查点阻断（ICB）疗法，特别是针对程序性死亡蛋白1（PD-1）及其配体PD-L1的疗法，已在多种晚期恶性肿瘤中展现出显著疗效。然而，在PD-L1低表达的肿瘤中，其治疗效果有限。因此，提高肿瘤的PD-L1表达，从而拓宽ICB的治疗窗口，是一个关键的策略。研究已知铜能够上调PD-L1表达，而基于铜死亡（cuproptosis）的纳米药物已被证明可以提升肿瘤PD-L1水平并与抗PD-L1疗法产生协同作用。另一方面，二硫死亡（disulfidptosis）作为一种新近定义的、由二硫键应激和葡萄糖剥夺下NADPH耗竭触发的程序性细胞死亡方式，其免疫调节功能尚未被充分探索。
本研究的出发点在于：单一模式的细胞死亡诱导常面临内在或获得性耐药。因此，利用非冗余的死亡机制来增强肿瘤免疫原性，是克服ICB耐药的关键前沿。铜离子（Cu）可与胱氨酸（Cystine）通过铜-硫（Cu-S）配位形成纳米晶体。基于此化学原理，本研究设计并构建了一种表皮生长因子受体（EGFR）靶向的铜死亡与二硫死亡协同递送靶向纳米药物，命名为Cadict。
结果
2.1 铜死亡与二硫死亡的双重诱导协同增强肿瘤抑制并增强ICB疗效
体外实验表明，铜死亡诱导剂CuCl2-Elesclomol（Cu-ES）和二硫死亡诱导剂BAY-876的联合使用，能协同增强微卫星稳定（MSS）CT26和高微卫星不稳定性（MSI-H）MC38结直肠癌细胞系的细胞死亡。更重要的是，这种双重处理能将PD-L1表达上调3.8倍，而铜死亡抑制剂TTM或二硫死亡抑制剂TCEP可以逆转这一效应，表明PD-L1的诱导与这两种死亡模式均相关。在CT26和MC38的同源肿瘤小鼠模型中，Cu-ES+BAY-876方案能够抑制肿瘤生长，并进一步提升抗PD-L1疗法的疗效。这种三联疗法（Cu-ES+BAY-876+抗PD-L1）重塑了肿瘤微环境，增加了CD4+/CD8+T细胞浸润和成熟树突状细胞，同时降低了肿瘤PD-L1水平。它还能克服内在的抗PD-L1耐药性，通过扩大功能性T细胞亚群、减少髓源性抑制细胞（MDSCs）浸润并提高M1/M2巨噬细胞比例，来逆转T细胞抑制。
然而，一个悖论现象是：尽管Cu-ES+BAY-876治疗能强效抑制肿瘤，但与对照组相比，它却导致肿瘤内总的CD4+/CD8+T细胞及效应T细胞亚群的浸润显著减少。这种免疫抑制性转变与PD-L1的急剧上调同时发生，而抗PD-L1疗法可以逆转这一现象。在CD8+T细胞与MC38细胞的共培养模型中，Cu-ES+BAY-876处理的肿瘤细胞虽然仍易被裂解，但抑制了CD8+T细胞中IFN-γ和颗粒酶B（GzmB）的产生，这一现象同样可被抗PD-L1阻断所缓解。这些结果表明，双重诱导铜死亡和二硫死亡不仅能发挥强大的细胞毒性，还能驱动PD-L1上调，从而使肿瘤对抗PD-L1治疗敏感。
2.2 Cadict纳米药物的合成与表征
为实现铜离子和胱氨酸的共递送以同时诱导两种细胞死亡，研究团队通过铜-二硫键配位自组装开发了Cadict。X射线衍射确认了其晶体结构含有胱氨酸和CuS的特征峰。X射线光电子能谱分析显示，63.5%的铜离子以Cu+形式存在，这有利于更有效地诱导铜死亡。透射电子显微镜元素映射证实了铜和硫在配位框架中的存在。为放大需要胱氨酸积累和葡萄糖剥夺的二硫死亡，Cadict在配位过程中整合了葡萄糖氧化酶（GOx）。为实现肿瘤靶向，纳米颗粒表面功能化了EGFR靶向肽GE11。最终形成的Cadict纳米颗粒直径约11.7纳米，分散性良好，在PBS中可稳定存在6天，并表现出良好的体内药代动力学特性（血浆半衰期约1.22小时）。
体内成像显示，静脉注射后，ICG标记的Cadict能在肿瘤部位逐渐积累，在12小时达到峰值并持续至48小时，其肿瘤荧光强度是对照组（游离ICG）的3倍。生物透射电镜和共聚焦显微镜观察证实，Cadict能通过内吞作用被肿瘤细胞有效摄取，并定位于溶酶体。在酸性（pH≈5.6）的溶酶体/肿瘤微环境下，Cu-S配位结构解离，实现药物的高效释放。电感耦合等离子体质谱分析表明，Cadict处理能使MC38细胞内的铜积累增加14.3倍。
2.3 Cadict在肿瘤细胞中引发铜死亡和二硫死亡
Cadict对肿瘤细胞表现出剂量和时间依赖性的细胞毒性，在4 μM浓度下可实现完全清除，但对正常结肠上皮细胞毒性 negligible，显示出良好的生物相容性。为阐明Cadict诱导细胞死亡的机制，研究使用了针对不同死亡途径的药理学抑制剂。结果显示，只有铜死亡抑制剂TTM和二硫死亡抑制剂TCEP能显著恢复细胞活力，且两者联用几乎能将细胞活力恢复到对照水平，强有力地证明Cadict诱导的细胞死亡是由这两种通路同时激活介导的。即使在更高剂量和更长时间暴露下，TTM和TCEP也能有效挽救细胞存活，显示出协同功效。
在机制上，胱氨酸过载会损害谷胱甘肽合成，而过量的铜离子会消耗作为关键硫醇铜螯合剂的谷胱甘肽。Cadict处理使细胞内GSH水平相比对照组降低了约70%，并协同性地大幅提升了活性氧的积累。铜死亡的特征是铜依赖的脂酰化二氢硫辛酰胺S-乙酰转移酶聚集。如预期所示，Cadict促进了DLAT聚集（表现为DLAT斑点），并下调了FDX1和LIAS的水平，这一效应可被TTM逆转。透射电镜进一步揭示了Cadict处理后的线粒体损伤，表现为线粒体收缩、嵴断裂和膜密度增加。与此同时，GOx消耗细胞内葡萄糖，限制了NADPH的产生，导致NADP+/NADPH比率升高，触发了胱氨酸积累和F-肌动蛋白收缩并从质膜脱离，支持了二硫死亡的发生。
2.4 Cadict在体内引发ICD样效应并激活抗肿瘤免疫应答
在MC38荷瘤小鼠模型中，Cadict显示出剂量依赖性的肿瘤抑制效果，在5 mg kg-1剂量下取得了最佳疗效与耐受性的平衡。与单组分治疗相比，Cadict诱导了最显著的肿瘤坏死、增殖活性降低和细胞死亡。重要的是，Cadict处理在肿瘤组织中诱导了DLAT聚集和F-肌动蛋白收缩，表明其在体内同时激活了铜死亡和二硫死亡。此外，Cadict引发了最高水平的热休克蛋白钙网蛋白暴露和高迁移率族蛋白B1的释放——这些都是免疫原性细胞死亡（ICD）的标志性损伤相关分子模式。
Cadict治疗提升了血清中IFN-γ和IL-6等促炎细胞因子水平，表明其引发了强烈的系统性炎症。它增加了循环中的树突状细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞以及脾脏中的DC和NK细胞。在肿瘤微环境中，Cadict增加了成熟DC的浸润。然而，与体外观察一致，尽管系统性免疫被激活，肿瘤内CD4+T、CD8+T和GzmB+CD8+T细胞的频率却不到对照组的一半，这可能与肿瘤内PD-L1表达升高有关。同时，Cadict处理提高了M1/M2和Th1/Th2比率，并减少了免疫抑制性的MDSCs和调节性T细胞。体内生物安全性评估显示，Cadict对肝、肾、心脏功能标志物无显著影响，组织学分析未见主要器官损伤，体重稳定，且具有良好的血液相容性。
2.5 Cadict通过Eif5b依赖性翻译上调PD-L1表达
为探究Cadict诱导PD-L1上调的机制，研究发现GOx、CuCl2或Cu-Cys单药治疗均可提升PD-L1水平，而Cadict的效应最强。用TTM或TCEP阻断任一死亡通路，都能有效逆转Cadict触发的PD-L1上调。有趣的是，Cadict并未改变PD-L1的mRNA水平，提示存在转录后调控。RNA测序分析显示，Cadict处理的细胞在核糖体蛋白、翻译因子和mRNA加工通路方面显著富集，暗示了翻译控制机制。
研究假设Cadict通过整合应激反应途径促进PD-L1翻译。支持这一观点的是，用ISR抑制剂ISRIB处理能完全消除Cadict诱导的PD-L1上调。在ISR过程中，翻译起始因子eIF2α的磷酸化会抑制翻译，但在应激条件下，eIF2D和eIF5B等替代因子可以进行补偿。通过分别敲低Eif2a、Eif2b、Eif5a和Eif5b，研究发现只有敲低Eif5b能强烈降低Cadict处理的MC38细胞中PD-L1蛋白水平，表明Eif5b在Cadict介导的PD-L1翻译中起关键作用。此外，用Ruxolitinib抑制IFN-γ信号通路并不影响Cadict诱导的PD-L1上调，而外源性IFN-γ能进一步放大该效应。这些数据表明，Cadict主要通过Eif5b依赖性翻译增强PD-L1表达，且不依赖于IFN-γ信号通路。
2.6 Cadict联合抗PD-L1疗法协同增强抗肿瘤疗效
鉴于Cadict诱导的肿瘤内PD-L1上调可能抑制T细胞活性并限制抗肿瘤疗效，研究假设将Cadict与抗PD-L1阻断联合使用会产生协同效应。在MC38荷瘤小鼠模型中，Cadict单药比低/高剂量抗PD-L1单药显示出更强的肿瘤抑制效果。将Cadict与任一剂量的抗PD-L1联合，都能进一步改善肿瘤控制，并呈剂量依赖性，证实了协同作用。Cadict联合高剂量抗PD-L1治疗组实现了最大的肿瘤消退，20%的小鼠达到完全缓解。
联合治疗显著提升了血清促炎细胞因子和IL-2的水平，并促进了脾脏DC、NK和T细胞的扩增。在肿瘤微环境中，Cadict增强了成熟DC和NK细胞的浸润，但 paradoxically 减少了CD4+/CD8+T、IFN-γ+CD4+T和GzmB+CD8+T细胞的比例。而抗PD-L1阻断逆转了这种T细胞抑制。联合治疗还进一步降低了MDSCs浸润，提高了肿瘤相关巨噬细胞的M1/M2极化比率。记忆T细胞分析显示，Cadict联合高剂量抗PD-L1治疗诱导了最高比例的脾脏中央记忆T细胞。
在肿瘤再攻击模型中，Cadict单药显示出比抗PD-L1单药更强的抗肿瘤效力，而联合治疗则表现出最强大、最协同的肿瘤控制效果，40%的小鼠实现了完全肿瘤清除。对脾脏中央记忆T细胞和肿瘤浸润效应记忆T细胞的分析表明，Cadict联合抗PD-L1治疗诱导了最高比例的这两种记忆T细胞亚群，为长期抗肿瘤免疫奠定了基础。最后，在免疫学上更“冷”的三阴性乳腺癌4T1模型中进行的验证实验表明，抗PD-L1单药疗效甚微，而Cadict单药能显著抑制肿瘤生长，Cadict联合抗PD-L1则能产生更优的抗肿瘤疗效，有效克服了该模型的内在耐药性。
讨论与结论
本研究开发了Cadict，一种通过铜-硫配位共递送铜离子、GOx和胱氨酸的EGFR靶向纳米平台。Cadict不仅通过协同诱导铜死亡和二硫死亡引发了强大的肿瘤细胞毒性，表现出ICD样特征，并增强了抗肿瘤免疫，还意外地激活了整合应激反应，导致Eif5b介导的PD-L1上调。这种双重作用协同性地使肿瘤对抗PD-L1治疗敏感，从而实现了强大的肿瘤抑制和持久的免疫记忆。这项工作建立了一种利用肿瘤氧化还原脆弱性来克服PD-L1低表达肿瘤内在耐药性并增强癌症免疫治疗疗效的新策略。尽管这一工程化的纳米平台开创了将氧化还原代谢失调与免疫调节相结合的治疗范式，但仍需关注维持足够的细胞内铜水平、在临床相关模型中进一步验证疗效与安全性，以及阐明铜死亡与二硫死亡在肿瘤微环境中的相互作用机制等挑战。
