《Advanced Science》：Adipocyte-Derived Exosomal miR-5099 Mitigates M1 Macrophage Polarization and Adipose Inflammation via c-Met/NF-κB Axis to Improve Metabolic Health
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本文揭示了源自脂肪细胞的外泌体在介导免疫-代谢调控中的关键作用。研究发现，抗肥胖中药活性成分雷公藤红素（Celastrol, CEL）可重编程脂肪细胞的微小核糖核酸（microRNA, miRNA）表达谱，其中miR-5099被特异性上调并富集于脂肪细胞分泌的外泌体（exosome, EXO）中。该外泌体（CEL-EXO）可被巨噬细胞摄取，其中的miR-5099通过直接抑制巨噬细胞的c-Met基因表达，进而抑制核因子κB（NF-κB）通路活性，从而阻碍促炎性M1型巨噬细胞的极化、迁移及炎症反应。在肥胖小鼠模型中，直接给予miR-5099可显著减轻脂肪组织炎症、肝脂肪变性和全身性胰岛素抵抗。该研究不仅阐明了CEL发挥抗肥胖及改善代谢作用的下游关键效应分子miR-5099及其通过“脂肪细胞-外泌体-巨噬细胞”轴的调控新机制，也为规避CEL直接应用的毒副作用、开发基于外泌体miRNA递送的靶向代谢性疾病疗法提供了新策略。
随着肥胖成为全球性健康危机，深入理解其引发的代谢功能障碍机制至关重要。其中，肥胖相关的脂肪组织（AT）慢性、低度炎症是驱动胰岛素抵抗和2型糖尿病等代谢性疾病的关键病理环节。白色脂肪组织（WAT）中的免疫细胞，特别是脂肪组织巨噬细胞（ATMs），在此过程中扮演了核心角色。在健康状态下，脂肪组织维持抗炎环境，富含M2型巨噬细胞；而在肥胖状态下，大量促炎性的M1型巨噬细胞浸润并极化，分泌肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）等炎症因子，加剧局部和全身性炎症与胰岛素抵抗。因此，靶向脂肪组织炎症，尤其是干预脂肪细胞与巨噬细胞之间的通讯，成为治疗肥胖相关代谢疾病的重要策略。
细胞外囊泡，特别是外泌体，作为细胞间通讯的关键信使，在生理和病理过程中发挥重要作用。脂肪细胞是循环中外泌体的主要来源之一，其分泌的外泌体富含蛋白质、脂质和各类核糖核酸（RNA），尤其是微小核糖核酸（miRNA），可作为“脂肪因子”远程调控其他组织的功能，或局部影响脂肪组织内的免疫细胞。多项研究表明，肥胖状态下脂肪细胞来源外泌体的miRNA谱发生显著改变，这些变化与代谢紊乱密切相关，使得外泌体miRNA成为极具潜力的疾病生物标志物和治疗靶点。
雷公藤红素（CEL）是从中药雷公藤根部提取的醌甲基化三萜类化合物，具有强大的抗肥胖、抗炎和免疫抑制作用。大量研究证实，CEL能显著减轻高脂饮食（HFD）诱导的肥胖小鼠的体重，改善其代谢指标。其经典作用机制包括提高瘦素（leptin）敏感性、减少摄食等。然而，CEL的直接应用伴随着严重的肝肾毒性、肠道损伤等副作用，极大地限制了其临床转化。因此，寻找能够介导CEL有益疗效、同时规避其毒性的下游效应分子，具有重要的科学和临床价值。
本研究的起点是探究CEL对脂肪细胞与巨噬细胞之间通讯的影响。研究者首先在动物水平证实，直接腹腔注射CEL（0.5 mg/kg/d）能有效降低肥胖小鼠体重、减少白色脂肪组织（包括腹股沟白色脂肪组织iWAT和附睾白色脂肪组织eWAT）质量、改善肝脂肪变性并增强胰岛素敏感性。然而，这种治疗也导致了脾脏、肾脏细胞耗竭以及严重的肠道溃疡等明显的器官毒性。这凸显了开发替代策略的必要性。
随后的体外实验发现，来自CEL处理的脂肪细胞的条件培养基（CEL-CM）能够显著抑制脂多糖（LPS）和干扰素-γ（IFNγ）诱导的骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）和RAW264.7巨噬细胞向M1表型极化，表现为M1标志基因（如诱导型一氧化氮合酶iNOS、白细胞介素-6 IL-6、肿瘤坏死因子-α TNF-α等）表达下调，iNOS蛋白染色减少，以及巨噬细胞迁移能力下降。重要的是，这种抑制作用并非CEL直接作用于巨噬细胞所致（虽然高剂量CEL本身也有免疫抑制效果），而是通过改变脂肪细胞的分泌组来实现的。
为了确定CEL-CM中起关键作用的成分，研究者将目光投向了外泌体。他们从对照和CEL处理的脂肪细胞培养基中分别分离出外泌体（Ctrl-EXOs和CEL-EXOs），并进行了系统的表征，包括透射电镜观察其杯状形态、纳米颗粒追踪分析（NTA）测定其粒径分布、以及通过免疫印迹（Western blot）检测其阳性标志物（HSP70、Flotillin、CD9、CD63）和阴性标志物（Calnexin）。功能实验表明，与Ctrl-EXOs相比，CEL-EXOs能更有效地被巨噬细胞内化，并显著抑制LPS/IFNγ诱导的M1极化，降低活性氧（ROS）水平，且这种抑制具有时间依赖性。相反，去除培养基中的外泌体后，CEL-CM的抗炎作用基本消失。此外，使用外泌体分泌抑制剂GW4869处理脂肪细胞，或敲低脂肪细胞中调控外泌体分泌的关键基因Rab27a/b，都会削弱CEL-CM对巨噬细胞M1极化的抑制作用。这些结果强有力地证明，CEL-EXOs是介导CEL抗炎作用的核心载体。
接下来，研究者在动物模型中验证了CEL-EXOs的代谢益处。在高脂饮食诱导的肥胖小鼠发展期（预防模型）和治疗期（治疗模型）中，定期注射源自CEL处理脂肪细胞的CEL-EXOs（无论是来自3T3-L1细胞系还是原代脂肪细胞），都能在不引起明显毒副作用的情况下，有效改善小鼠的葡萄糖耐受性和胰岛素敏感性，减少白色脂肪组织中M1巨噬细胞的浸润（F4/80+和CD11c+细胞减少），下调脂肪组织和肝脏中M1炎症相关基因的表达，减轻脂肪细胞肥大和肝脏脂肪变性。这些效果显著优于对照外泌体（Ctrl-EXOs）的处理。
既然外泌体的功能取决于其运载的“货物”，那么CEL-EXOs中究竟是何种成分发挥了主导作用？通过对外泌体进行蛋白质组学分析未能找到明确答案后，研究者将重点转向了miRNA。他们发现，在脂肪细胞中敲除miRNA加工的关键酶Dicer，会完全消除CEL-EXOs的抗炎作用。随后，通过对CEL-EXOs和Ctrl-EXOs进行miRNA深度测序，他们筛选出多个差异表达的miRNA。经过体外功能验证，miR-5099脱颖而出：它在CEL处理的脂肪细胞及其外泌体中表达显著上调；直接转染miR-5099模拟物（mimic）到巨噬细胞中，能有效抑制LPS/IFNγ诱导的M1极化标志基因表达、iNOS蛋白水平以及ROS生成；而过表达miR-5099的巨噬细胞也表现出类似的抗炎表型。
对miR-5099的组织分布分析显示，其在白色脂肪组织中表达较高，但在肥胖小鼠的脂肪组织、血清及外泌体中水平下降。而CEL处理能在体内外上调脂肪细胞中miR-5099的表达。机制上，CEL可能通过上调转录因子GATA2的表达，促进其与miR-5099启动子区的结合，从而激活miR-5099的转录。这解释了CEL调控miR-5099表达的分子基础。
为了阐明miR-5099抑制M1极化的下游机制，研究者对经miR-5099处理的M1巨噬细胞进行了转录组测序。基因集富集分析（GSEA）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析均提示，炎症相关通路，特别是核因子κB（NF-κB）信号通路被显著抑制。通过生物信息学预测和实验验证，研究者将目标锁定在酪氨酸激酶受体c-Met（也称为肝细胞生长因子受体）上。双荧光素酶报告基因实验证实，miR-5099能够直接结合到c-Met基因3‘非翻译区（3’UTR）的特定位点，导致其mRNA水平下降。功能上，在巨噬细胞中敲除c-Met基因，能够模拟miR-5099过表达的效果，即抑制M1极化、降低NF-κB通路关键蛋白p65的磷酸化水平、减少ROS产生和细胞迁移。反之，在巨噬细胞中过表达c-Met，则能够逆转miR-5099对M1极化和NF-κB通路的抑制作用。这些证据清晰地勾勒出一条“miR-5099 – c-Met – NF-κB”调控轴，阐明了外泌体miR-5099抑制巨噬细胞炎症反应的分子途径。
最后，研究通过基因敲除实验在体内外确证了miR-5099的核心地位。在脂肪细胞中敲除miR-5099后，其所产生的外泌体（CEL-KO-EXOs）完全丧失了CEL-EXOs的抗炎和改善代谢的功效。在肥胖小鼠中，注射这种缺失miR-5099的外泌体，无法改善葡萄糖耐受和胰岛素抵抗，也无法抑制脂肪组织炎症和巨噬细胞浸润。更有力的是，直接给肥胖小鼠静脉注射合成的miR-5099模拟物（agomiR-5099），能够重现甚至超越CEL-EXOs的治疗效果：显著降低体重和脂肪量，大幅改善全身糖脂代谢和胰岛素敏感性，强力抑制脂肪组织内多种巨噬细胞亚群的浸润和炎症因子表达，并减轻肝脂肪变性。单细胞转录组测序分析进一步在单细胞分辨率上证实，miR-5099处理能广泛下调脂肪基质血管组分（SVF）中巨噬细胞的炎症相关基因谱。此外，miR-5099还能直接增强脂肪细胞、肌细胞和肝细胞的基础胰岛素信号通路（如增加蛋白激酶B AKT的磷酸化），提示其具有独立于抗炎作用之外的直接胰岛素增敏效应。
综上所述，本研究首次系统阐明了脂肪细胞来源的外泌体miR-5099在连接CEL治疗与代谢改善之间的桥梁作用。CEL通过上调脂肪细胞GATA2表达，促进miR-5099转录并将其包装进外泌体。这些富含miR-5099的外泌体被邻近或循环中的巨噬细胞摄取后，miR-5099通过靶向抑制c-Met，进而阻断NF-κB信号通路，从而遏制M1型巨噬细胞的过度活化和炎症反应，最终缓解脂肪组织炎症和全身性胰岛素抵抗。该发现不仅揭示了CEL发挥有益作用的一种全新、安全的“间接”机制，规避了其直接毒性，也将miR-5099确立为一个具有双重功能（抗炎和胰岛素增敏）的新型治疗分子。这项研究为理解脂肪-免疫细胞对话在代谢健康中的核心地位提供了新视角，并为开发基于外泌体或miR-5099本身的、靶向肥胖及相关代谢综合征的创新疗法奠定了坚实的理论基础。
