《Journal of Ethnopharmacology》：From Multi-omics Discovery to Experimental Validation: GPC4 Mediates the Anti-neuroinflammatory Effects of Buyang Huanwu Decoction via TLR4/NF-κB Signaling in Ischemic Stroke with Qi Deficiency and Blood Stasis Syndrome
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气虚血瘀型缺血性卒中治疗中补阳还五汤通过调控GPC4/TLR4/NF-κB信号通路抑制神经炎症，多组学验证其机制并证实关键成分与靶点结合。
张晨星|吴欣雨|于哲轩|徐冠峰|杨洁宏|邵重宇|万海同
浙江中医药大学基础医学院，中国杭州310053
摘要
民族药理学意义
补阳还五汤（BYHW）是一种源自清代王清仁《医林校正》的经典中药方剂。研究一致表明，BYHW作为治疗气虚血瘀（QDBS）综合征引起的缺血性中风（IS）的民族药物具有丰富的传统使用证据。研究目的
确定BYHW在治疗QDBS综合征引起的IS中的关键差异表达蛋白及其抗神经炎症作用机制。材料与方法
通过禁食、负重游泳和MCAO/R方法建立了QDBS综合征的中风大鼠模型。通过神经功能评分、TTC染色、组织病理学、血液流变学和凝血功能评估来评价BYHW的疗效。整合蛋白质组学、转录组学和网络药理学筛选关键靶点和通路，并通过分子对接、分子动力学模拟、Western blot、RT-qPCR和免疫荧光进行验证。此外，使用siRNA敲低GPC4证实了其在TLR4/NF-κB信号通路调节中的作用。结果
BYHW有效改善了模型大鼠的神经功能缺陷，减少了梗死面积，纠正了血液流变学异常，并恢复了凝血功能。多组学整合分析表明GPC4是关键差异表达蛋白，且与TLR4/NF-κB信号通路密切相关。机制研究表明GPC4和TLR4在星形胶质细胞中共同表达。BYHW显著抑制了GPC4和TLR4的表达以及NF-κB的磷酸化，从而下调了下游促炎因子TNF-α和IL-1β的转录和蛋白水平。分子对接和分子动力学模拟显示，BYHW的活性成分（calycosin、calycosin-7-glucoside、formononetin、ononin和paeoniflorin）与GPC4具有很强的结合亲和力。进一步研究表明，敲低GPC4可抑制TLR4/NF-κB信号通路并逆转促炎效应，证实BYHW的治疗作用是通过这一通路介导的。结论
本研究首次确定GPC4是QDBS综合征引起的中风中的关键差异表达蛋白，并揭示了BYHW通过靶向TLR4/NF-κB信号通路来缓解神经炎症，为其临床应用提供了科学依据。引言
缺血性中风（IS）是全球第二大死亡原因，占所有死亡人数的11.6%。它也是导致死亡和残疾的第三大原因，占全球伤残调整生命年（DALYs）的5.7%（GBD 2021 Stroke Risk Factor Collaborators, 2024）。IS的病理机制涉及一个复杂的多步骤过程，包括能量代谢紊乱（Jin等，2022）、氧化应激（Liu等，2022）、炎症反应（Zhou等，2024）和细胞凋亡（Puyal等，2013）等多种机制。
在中医理论框架下，气虚血瘀（QDBS）综合征被认为是导致脑血栓形成和中风的重要因素（Zhang等，2021）。补阳还五汤（BYHW）被认为是治疗与QDBS综合征相关的中风的经典方剂（Hang等，2022）。该方剂源自清代王清仁的《医林校正》，由七种草药组成：五味子根、当归根、赤芍根、荆芥根、红花和桃仁。从现代生物学角度来看，QDBS综合征与能量代谢紊乱（Li等，2018）、血小板功能障碍（Zhan等，2023）和炎症反应（Huang等，2019）密切相关。
越来越多的证据表明神经炎症在IS的发病机制中起重要作用（Xu等，2020；Xu等，2021）。研究表明TLR4参与了与IS相关的炎症级联反应（Luo等，2022；Zhang等，2025）。TLR4与其配体结合后激活NF-κB，进而促进包括TNF-α和IL-1β在内的多种促炎因子的表达（Xu等，2024）。虽然TLR4/NF-κB通路被认为是主要的炎症通路，但其在IS中的调节机制尚不清楚。在探索这一通路的潜在调节因子时，glypican-4（GPC4）成为了一个研究热点。然而，GPC4在缺血性中风中的具体作用和机制仍不明确。
GPC4是一种肝素硫酸盐蛋白聚糖（HSPG），通过GPI连接锚定在细胞膜上。这种GPI锚将蛋白质牢固地固定在膜上，而其所有功能活性域，包括蛋白质核心和肝素硫酸链，都位于细胞外空间（Muendlein等，2025）。它由发育中的中枢神经系统中的星形胶质细胞和神经元表达，主要通过调节细胞生长、分化、迁移等生理和病理过程发挥作用（Allen等，2012）。尽管GPC4与多种疾病相关，包括癌症（Muendlein等，2022a；Zhao等，2024）、代谢紊乱（Chen等，2024；Yu等，2024）和外周动脉疾病（Muendlein等，2022b；Muendlein等，2022c），但其在IS中的具体机制仍不清楚。研究表明GPC4在TLR4信号通路中起关键作用，被认为是TLR4/NF-κB通路的重要增强因子（He等，2022）。然而，其在IS中的精确功能和临床意义仍需进一步研究。
本研究综合运用蛋白质组学、转录组学、网络药理学、分子对接和分子动力学模拟技术，系统地确定了QDBS综合征中的关键驱动通路。重点探讨了TLR4/NF-κB通路与关键差异表达蛋白GPC4之间的关联，并深入研究了GPC4在调节炎症中的作用机制。研究结果通过Western blot、RT-qPCR和免疫荧光方法得到了实验验证。此外，通过siRNA介导的GPC4功能丧失实验进一步证实GPC4是驱动这一炎症通路的核心靶点。
部分内容
抗体
抗GPC4、抗NF-κB p65（1:10,000）、抗TNF-α（1:1,000）和抗IL-1β（1:1,000）购自Proteintech（中国）。抗TLR4（1:1,000）、抗NF-κB p-p65（1:1,000）、抗GFAP（1:500）和抗β-actin（1:20,000）购自HuaBio（中国）。动物与处理
从浙江中医药大学动物中心获得了52只健康的成年雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，年龄为6至8周，体重（240±20）克（伦理编号IACUC-20240805-12）。饲养环境为...BYHW缓解MCAO/R大鼠的QDBS综合征
为了评估BYHW对MCAO/R模型大鼠QDBS综合征的影响，进行了体重测量和前肢握力测试。图1A概述了整个实验流程，包括第1天的模型诱导、随后的表型观察以及第21天的样本收集。结果表明，与对照组相比，模型大鼠的体重增长显著减少（p < 0.01）。相比之下，BYHW干预有效缓解了...讨论
IS是一种以高发病率和死亡率为特征的疾病，其中QDBS综合征是最常见的表现形式（Jiang等，2017）。尽管BYHW是治疗与QDBS综合征相关的中风的经典方剂，并显示出显著疗效（Huang等，2022；Huang等，2025；Mo等，2024），但其背后的机制尚未得到系统阐释。本研究的主要创新在于首次...结论
总之，本研究确定了GPC4是QDBS综合征与缺血性中风之间的新型分子连接点。我们进一步阐明BYHW通过破坏GPC4/TLR4/NF-κB信号通路来缓解神经炎症，其活性成分直接作用于GPC4。这些发现不仅为BYHW的临床疗效提供了机制基础，还表明GPC4是QDBS综合征相关中风的潜在治疗靶点。作者贡献声明
邵重宇：概念构思。杨洁宏：监督、项目管理、概念构思。徐冠峰：项目管理。张晨星：撰写-审稿与编辑、概念构思。于哲轩：方法学。吴欣雨：数据管理、概念构思。万海同：监督、项目管理、概念构思未引用参考文献
GBD 2021 Stroke Risk Factor Collaborators, 2024; O'Callaghan等，2018.利益声明
作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。资助
该项目得到了2024年建兵凌岩项目（项目编号：2024C03105）的支持利益冲突声明
作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
