《Advanced Science》：Pancancer Fine-Mapping of Mutational Intolerance Identifies CHEK1 as an Immunosuppressive Driver in Lung Adenocarcinoma
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本文提出了一种名为miDriver的计算框架，通过对比癌与正常组织的体细胞突变模式，系统性地鉴定了在多种癌症中突变不耐受但对正常组织相对耐受的基因（MIGs），并在肺腺癌（LUAD）中聚焦CHEK1进行了深入机制探索。研究发现，MIGs显著富集于合成致死相互作用和细胞周期通路，并与患者预后密切相关。文章揭示了CHEK1通过磷酸化p53上调MIF的表达和分泌，进而通过MIF-CD74轴驱动巨噬细胞向M2样极化，重塑免疫抑制性肿瘤微环境（TME），从而促进肿瘤进展。体内外实验证明，靶向CHEK1-MIF轴（特别是CHEK1）能广泛逆转免疫抑制，抑制肿瘤生长。该研究为开发选择性靶向MIGs、同时破坏肿瘤内在适应性并重塑免疫抑制微环境的癌症特异性疗法提供了新范式。
研究背景与MIGs的发现
癌症基因组学的一个核心挑战在于识别对肿瘤生存至关重要，但在正常组织中可耐受突变的基因。这类突变不耐受基因（Mutation-Intolerant Genes, MIGs）因其在癌变环境中展现出负向选择压力和肿瘤特异性必需性，成为极具潜力的治疗靶点。然而，在全基因组范围内系统性地鉴定这类基因仍面临技术和分析上的困难。本研究开发了一个名为miDriver的计算框架，通过整合大规模癌症基因组（如TCGA）和正常组织队列（如SomaMutDB）的体细胞突变数据，系统比较了肿瘤与匹配正常组织间的突变模式。该分析在13种癌症类型的8,096个肿瘤中鉴定出1,020个MIGs。引人注目的是，这些MIGs在合成致死（Synthetic Lethality, SL）基因对、细胞周期进程通路以及与临床结局相关的生物标志物中显著富集。CRISPR筛选进一步证实，MIGs（尤其是CHEK1）是癌症特异性的脆弱性节点，抑制这些基因会损害肿瘤细胞的增殖和迁移能力。
MIGs的临床意义与预后价值
通路富集分析显示，MIGs显著富集于细胞周期相关过程，约占所有MIGs的30%。这些基因同时也富集于已知的药物靶点和FDA批准的肿瘤抑制剂相关基因。研究人员评估了MIGs表达与患者总生存期（OS）的关联，发现大约12%的MIGs与患者生存显著相关，其中40%被归类为细胞周期基因。皮肤黑色素瘤（SKCM）、胰腺腺癌（PAAD）和肺腺癌（LUAD）中含有最多与生存相关的MIGs。
为了评估MIGs的预后价值，研究基于细胞周期相关的MIGs构建了LASSO Cox回归模型。由此产生的MIG相关特征谱（CellCycle MIG-related Prognostic Score, CMPS）在多种癌症中能显著预测总生存期，平均C-index达到0.92。时间依赖性ROC分析显示，1年、3年和5年生存期的平均AUC值分别约为0.89、0.79和0.72。高风险MIGs，如DTL、USP39、CHMP2A、FBXO5、TINF2和CHEK1，已被先前研究证明与肿瘤进展和不良预后相关。利用CMPS对患者进行风险分层，高风险组患者在多种恶性肿瘤中均表现出显著更差的生存结果。
MIGs通过促免疫抑制微环境驱动肿瘤进展
鉴于多个MIGs此前被报道通过调节肿瘤微环境（Tumor Microenvironment, TME）促进肿瘤进展，研究进一步探索了CMPS与免疫细胞浸润的关系。低CMPS的肿瘤显示出抗肿瘤免疫细胞（如M1巨噬细胞、CD8+T细胞和记忆B细胞）的显著富集。相反，高CMPS的肿瘤与促肿瘤免疫景观相关，表现为M2巨噬细胞浸润增加和M1巨噬细胞减少。
通过整合6种癌症类型的15个公开scRNA-seq数据集（共280个样本，874,132个细胞），研究评估了预后相关MIGs在正常邻近组织（NATs）、原发肿瘤和转移灶上皮细胞中的表达。结果显示，在所有癌症类型中，预后MIGs在肿瘤细胞中持续上调，在LUAD、LIHC、STAD和COADREAD中，这些基因在转移瘤中表达进一步升高。在表达预后MIGs的癌细胞中，观察到包括LDHB、HMGA1、UBE2C、NPM1、CXCL1/2/3、S100A9、S100A8、FGF3、PLAC8和药物靶点TACSTD2在内的多个已知癌基因显著上调。通路富集分析揭示了促肿瘤发生过程（如细胞周期、MYC靶点、E2F靶点、mTORC1信号、PI3K/AKT/mTOR信号和糖酵解）的激活，而关键的肿瘤杀伤免疫效应通路（如B细胞受体信号、NK细胞介导的细胞毒性和干扰素-α/γ反应）则受到抑制。
相关性分析表明，预后MIGs的高表达与抗肿瘤免疫细胞群（如细胞毒性CD8 T细胞、M1样巨噬细胞、自然杀伤细胞和记忆B细胞）的浸润减少有关，而具有免疫抑制功能的FOXP3+调节性T细胞（C2_FOXP3_CD4T）则显著富集。细胞间通讯分析进一步指出，表达预后MIGs的癌细胞分泌巨噬细胞迁移抑制因子（Macrophage Migration Inhibitory Factor, MIF），MIF与免疫细胞上的CD74/CD44受体结合以促进免疫抑制。
聚焦LUAD：MIGs驱动肿瘤进展并重塑TME
在MIGs富集度最高的三种癌症中，LUAD具有相匹配的肿瘤和NAT基因表达谱，适合深入研究MIGs的功能相关性。在LUAD肿瘤中，MIGs的表达显著高于NAT。进一步分析将CDC45、CHEK1和DHX37确定为候选基因进行功能验证。这三个基因在肿瘤组织中均显著过表达，且高表达与更差的OS显著相关。在A549细胞系中稳定敲低CDC45、CHEK1或DHX37能显著抑制LUAD细胞的增殖和迁移，表明这些MIGs与肿瘤进展呈正相关。
RNA-seq分析揭示了基因敲低后的转录组变化。CHEK1敲低抑制了与癌症干性相关的TSPAN8和SOX2的表达。同时，野生型细胞相比CHEK1敲低细胞，肿瘤促进基因BPIFB1和MUC13表达升高，而肿瘤抑制基因GPR27和FOXL2表达降低。GSEA分析表明，CHEK1敲低后，与细胞周期、端粒功能、E2F和MYC靶点相关的通路受到抑制，这些通路对癌症干性和TME调节至关重要。DHX37和CDC45的敲低也导致了类似的关键通路失调。
CRISPR筛选揭示MIG破坏是LUAD中的合成致死脆弱性
为了系统评估MIGs在LUAD中的功能特征和治疗潜力，研究设计了一个基于CRISPR的编辑筛选，靶向健康人体组织中普遍存在的MIG变异。通过在LUAD（H1299）和非恶性（HEK293）细胞系中进行平行筛选，旨在鉴定在癌细胞中具有选择性致死性而在健康对照中可耐受的突变。整合Perturb-seq的单细胞转录组分析显示，大多数MIG扰动在LUAD细胞中诱导了合成致死脆弱性。值得注意的是，这种脆弱性不仅限于LUAD来源的MIGs（如VPS25和CHEK1），在其他癌症类型中鉴定出的大量MIGs在LUAD中也表现出合成致死性。MIG编辑的细胞普遍显示出其对应基因表达的显著降低，提供了靶向编辑和功能验证的直接转录证据。GSEA分析显示，CHEK1编辑的LUAD细胞中，对其生存至关重要的MYC靶点和mTORC1信号通路被显著抑制。重要的是，这种收敛的转录扰动对LUAD细胞是致命的，但能被非恶性细胞耐受，揭示了癌症特异性的脆弱性。
CHEK1通过激活肿瘤内在适应性和免疫逃逸驱动LUAD进展
scRNA-seq分析将LUAD癌细胞重新聚类为八个不同的亚群，其中C4亚群显著富集了与LUAD不良生存最相关的MIG——CHEK1。CHEK1高表达的癌细胞（C4_CHEK1）显示出增殖和干性相关基因（如PCNA、MKI67、SOX2和MIF）的上调。CHEK1表达在肿瘤组织中显著高于NAT，在转移灶中又高于原发肿瘤，并且随着LUAD进展（晚期 vs. 早期）而增加。通路富集分析显示，CHEK1高表达癌细胞富集于致癌通路（如E2F/MYC靶点、PI3K/AKT/mTOR、细胞周期），但免疫激活通路（如炎症反应、细胞因子信号）受到抑制。
相关性分析和空间分析揭示，CHEK1高表达的癌细胞与免疫抑制性的IL4I1+巨噬细胞和LAG3+CD8+T细胞亚群呈强正相关。细胞间相互作用分析确定MIF是来自CHEK1高表达癌细胞的关键配体，其与IL4I1+巨噬细胞的相互作用信号最强。鉴于CHEK1能使p53在Ser20位点磷酸化，而TP53共同占据活跃的MIF调控元件，研究人员假设CHEK1通过p53磷酸化来调节MIF表达。实验证实，在共转染野生型p53的H1299细胞中，增加CHEK1剂量可诱导MIF呈剂量依赖性上调。在p53缺失的H1299细胞中，单独表达p53仅能适度诱导MIF，而共表达Flag-CHEK1与p53则能强劲增加MIF水平。ELISA实验证实，CHEK1过表达显著增强了MIF的分泌。在稳定敲低CHEK1的A549细胞中重新引入CHEK1可恢复MIF表达，并伴随着内源性p53 Ser20磷酸化的增加。这些结果确立了CHEK1通过p53 Ser20位点的磷酸化依赖性激活来上调MIF表达和分泌。
CHEK1通过CHEK1-p53-MIF轴塑造免疫抑制微环境
为了评估CHEK1和MIF在肺腺癌（LUAD）中的空间和蛋白质水平关系，研究采用了多重免疫荧光技术。结果显示，CHEK1和MIF在癌细胞中强共定位，约91%的CHEK1阳性癌细胞也同时为MIF阳性。与CHEK1低表达的癌细胞相比，CHEK1高表达的癌细胞显示出显著更高的MIF蛋白信号强度。TME的空间图谱显示，CHEK1高表达的癌细胞与M2样巨噬细胞强共富集，并且相较于CHEK1低表达细胞，其与IL4I1+巨噬细胞的空间距离显著更近。
鉴于MIF能驱动巨噬细胞M2极化并介导CHEK1高表达癌细胞与M2样巨噬细胞之间的串扰，研究通过建立间接共培养系统来检验调节CHEK1表达是否能直接调控巨噬细胞极化。流式细胞术分析M1/M2标记物（CD80/CD206）显示，与对照培养基相比，来自shCHEK1细胞的培养基条件显著减弱了M2样极化。从共培养物中分离出的巨噬细胞的转录组分析进一步表明，shCHEK1组与shNC对照组相比有550个差异表达基因。GSEA分析显示，shCHEK1组中抗肿瘤巨噬细胞程序被显著激活。使用重组人MIF蛋白梯度处理PMA分化的THP-1巨噬细胞，结果证实MIF单独能以剂量依赖性方式促进M2样极化，这从功能上佐证了肿瘤细胞中CHEK1上调与随后TME中M2样极化之间的机制联系。
靶向CHEK1-MIF轴的体内治疗效果与免疫重塑
为了评估CHEK1-MIF轴的体内治疗潜力，研究在皮下接种肺癌的小鼠模型中分别使用了CHEK1抑制剂（SRA737）或MIF抑制剂（ISO-1）。CHEK1抑制能显著抑制肿瘤生长，降低肿瘤体积和最终肿瘤重量，且对体重影响可忽略不计。MIF抑制也导致了肿瘤重量的显著减少，尽管效果较CHEK1抑制更为温和。
scRNA-seq分析揭示了相关的免疫重塑：CHEK1抑制降低了肿瘤细胞丰度，增加了活化的T细胞，并广泛逆转了免疫抑制。具体而言，它显著降低了M2/M1巨噬细胞比率，增加了活化的Cd3+T细胞比例，并减少了耗竭性Lag3+Cd8+T细胞和调节性Foxp3+Ctla4+T细胞的比例。相比之下，MIF抑制的免疫调节作用范围较窄：虽然它显著降低了M2/M1比率并增加了活化的CD3+T细胞，但并未改变耗竭性或调节性T细胞亚群的比例。这种功能差异可能反映了巨噬细胞极化相较于T细胞耗竭状态具有更快的可塑性。CHEK1抑制所带来的更广泛、更协调的免疫调节作用，突显了其在驱动髓系和淋巴系免疫抑制中的核心上游作用。
此外，为了评估CHEK1在接受免疫治疗的LUAD患者中的临床相关性，研究分析了一个包含33名接受抗PD-1治疗患者的单细胞RNA测序队列。校正年龄、性别和吸烟史后，广义线性模型显示，CHEK1阳性癌细胞的比例与治疗反应呈统计学显著的负相关。模型显示出良好的预测准确性（AUC = 0.725）。一致地，治疗应答者比非应答者拥有显著更少的CHEK1高表达癌细胞。
结论
本研究确立了突变不耐受基因（MIGs）作为一类先前被忽视的、独立于传统癌基因-抑癌基因范式的癌症脆弱性。通过跨癌种精细定位和多组学整合分析，研究证明MIGs通过两种机制维持肿瘤进展：维持肿瘤内在适应性和促进免疫逃逸。研究在LUAD中阐明了一个CHEK1–p53–MIF–CD74轴，该轴支持肿瘤内在适应性并驱动巨噬细胞向M2样极化，从而塑造免疫抑制性生态位。靶向该轴可显著逆转免疫抑制，并且高CHEK1表达与抗PD-1治疗耐药相关，这凸显了MIGs作为对正常组织毒性最小的肿瘤特异性治疗靶点的潜力。
