《Journal of Hazardous Materials》：Cell uptake of mixtures of different-sized nanoplastics: interplay and mechanism
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纳米塑料混合尺寸的细胞摄取机制研究显示，100nm的R100PS通过触发包被介导的内吞作用显著促进50nm的G50PS摄取（最高增加74.2%）。在含血清条件下，G50PS对R100PS的摄取呈现复杂双向调控（增强71.3%至抑制38.2%），其机制与蛋白冠竞争相关。研究揭示了多尺寸纳米塑料生物相互作用的复杂性，为毒性评估提供新依据。
Jie Liu|Yuan-Yuan Liu|Yuan Guo|Zheng Chu|Lu-Lu Chen|Huan Tang|Aoneng Cao|Haifang Wang
上海大学纳米化学与纳米生物学研究所，中国上海200444
摘要
现实世界中的纳米塑料总是呈现出较大的尺寸分布。不同尺寸的纳米塑料的内吞机制是否存在差异？为了解答这一基本问题，本文研究了在共同暴露条件下，50纳米（G50PS，浓度为2.5–10 μg/mL）和100纳米（R100PS，浓度为10–60 μg/mL）的聚苯乙烯纳米塑料的细胞摄取情况，其数量比介于0.5:1到12:1之间。结果表明，与单独暴露相比，R100PS的存在通常会增强G50PS的细胞摄取（最多可增强74.2%），因为R100PS能够更容易地触发囊泡蛋白介导的内吞作用，将附近的G50PS带入细胞内。G50PS对R100PS摄取的影响更为复杂，在含有血清的培养基中，根据混合条件的不同，既可能增强（最多增强71.3%），也可能抑制（最多抑制38.2%）R100PS的摄取。我们提出了一种涉及蛋白质冠层的机制来解释R100PS在含有血清的培养基中的内吞行为：G50PS对有限数量的特定血清蛋白的竞争改变了R100PS的蛋白质冠层，从而根据G50PS和R100PS的浓度比改变了其摄取情况。这一发现揭示了纳米塑料与生物体相互作用的复杂性，并为评估纳米塑料的毒性提供了新的见解。
引言
纳米塑料（NPLs）被定义为具有纳米级尺寸的小塑料颗粒[1]，广泛存在于商业产品中，并且在水中、土壤和空气中也很常见[2]、[3]、[4]。例如，Chen等人分析了中国上海冬季大气中的微/纳米塑料，发现NPLs（≤ 1.0 μm）占总微塑料（0.056至18 μm）质量的36.3%，而NPLs的数量浓度占99.97%，是不含NPLs的微塑料数量的3055倍[5]。NPLs可以通过口服摄入、呼吸吸入和皮肤接触进入人体[5]，并能够穿透各种屏障，在不同的器官、组织、细胞和亚细胞结构中积累，对公共健康构成潜在风险[6]。最近的研究表明，NPLs与生殖毒性、心血管疾病、神经系统疾病、炎症性肠病和癌症有密切关联[7]、[8]、[9]。由于NPLs在细胞中的积累可能导致不良影响，影响细胞功能，并在人体内引发毒性[8]、[10]、[11]、[12]、[13]，因此迫切需要研究NPLs的细胞摄取机制及其影响因素。在最近的一篇综述中，Lamoree等人强调了在研究微/纳米塑料潜在危害时，确认颗粒在细胞或目标器官中的存在或摄取情况的重要性[8]。
多项体外研究表明，NPLs的生物利用度取决于其尺寸[14]、[15]、[16]，这与颗粒尺寸是影响纳米颗粒细胞摄取的最重要因素之一这一共识一致[12]、[17]、[18]。然而，大多数研究都是使用单一尺寸的纳米塑料进行的[13]，忽略了它们在环境中的多尺寸特性[5]、[19]。甚至有研究发现，当不同尺寸的纳米颗粒同时存在时，它们会相互影响彼此的摄取[17]、[20]、[21]、[22]、[23]。最初，我们观察到100纳米的二氧化硅颗粒可以增强HeLa细胞对50纳米颗粒的摄取，而50纳米的二氧化硅颗粒则会略微抑制100纳米颗粒的摄取[17]、[22]。在另一项研究中，也观察到了40纳米和100纳米的羧基化聚苯乙烯（PS）纳米颗粒在含有血清的培养基中24小时内的摄取情况[20]，但具体机制尚未明确。此外，已有报道指出，不同尺寸的混合NPLs在体外[24]、[25]和体内[26]的毒性效应与单一尺寸的NPLs不同。因此，研究不同尺寸NPLs的细胞摄取行为及其背后的机制和影响因素具有重要的科学意义。
在这项研究中，我们探讨了HeLa细胞在无血清和含血清培养基中，混合暴露于绿色荧光标记的50纳米纯PS纳米塑料（G50PS）和红色荧光标记的100纳米纯PS纳米塑料（R100PS）后的摄取情况，暴露剂量和暴露时间各不相同。选择球形PS纳米颗粒作为模型，是因为它们常用于实验室中研究纳米塑料与生物系统之间的基本相互作用，且PS塑料在环境中非常普遍[27]、[28]。最近，Chen报告称，在中国上海冬季大气中，PS是0.056–0.1 μm范围内NPLs的主要成分（占比超过40%[5]。我们选择50纳米和100纳米的颗粒尺寸，不仅因为它们在各种环境样本中被检测到[5]，还因为它们在NPLs和其他纳米颗粒的生物学研究中被广泛使用[29]。HeLa细胞系是最常用的研究纳米颗粒毒性和纳米颗粒-细胞相互作用的细胞模型[30]、[31]。在我们之前关于混合尺寸纳米颗粒摄取的研究中，也使用了相同的细胞系[17]、[22]、[32]。使用相同的细胞系可以方便地比较不同纳米颗粒和暴露条件的结果。本研究旨在揭示不同尺寸混合NPLs的细胞摄取行为及其背后的机制，从而加深我们对NPLs尺寸异质性这一重要问题的理解。
PS纳米塑料的特性
G50PS、R100PS、50纳米纯PS纳米塑料（记为50PS）和100纳米纯PS纳米塑料（记为100PS）购自Thermo Fisher（美国）。关于它们的详细特性信息见补充数据（第1.3节）。
细胞培养、细胞活力检测和细胞内活性氧（ROS）测量
人上皮宫颈癌细胞系HeLa由中国科学院细胞库（上海）提供。细胞在高葡萄糖DMEM培养基（含4.5 g/L葡萄糖）中培养。
PS纳米塑料的性质
G50PS和R100PS的平均尺寸分别为41.6纳米（图1a、d）和94.3纳米（图1b、e），它们的尺寸范围较窄，因此可以通过透射电子显微镜（TEM）轻松区分（图1c）。这两种PS纳米塑料都带有负电荷，可以在水溶液中形成均匀稳定的分散体（表S1）。实际上，大多数环境中的微/纳米塑料在环境pH条件下通常带有负电荷[35]。PS纳米塑料的荧光标记非常稳定，降解率低于5%
结论
本研究探讨了不同尺寸PS纳米塑料在细胞摄取过程中的相互作用和相关机制。总体而言，无论是在无血清还是含血清的培养基中，R100PS都能促进G50PS的囊泡蛋白介导的细胞摄取，这种促进作用依赖于PS的浓度和孵育时间。结合其他非能量依赖性的摄取途径，观察到G50PS的总体摄取量增加了（最多达到对照组的74.2%）。
环境影响
我们的研究表明，在常用的浓度（2.5–60 μg/mL）下，混合尺寸纳米塑料的细胞摄取情况与单一尺寸纳米塑料有显著差异，且混合尺寸纳米塑料的总体摄取行为取决于纳米塑料的比例和浓度。特别是在无血清和含血清的培养基中，较大的纳米塑料通常会增强较小纳米塑料的囊泡蛋白介导的摄取，而较小的纳米塑料通常比较大的纳米塑料更具毒性。
作者贡献声明
Aoneng Cao：撰写——审稿与编辑、撰写——初稿、监督、资金获取、概念构思。Huan Tang：撰写——审稿与编辑、实验研究、数据分析。Haifang Wang：撰写——审稿与编辑、撰写——初稿、监督、方法设计、资金获取、概念构思。Jie Liu：撰写——审稿与编辑、撰写——初稿、数据可视化、方法设计、实验研究、数据分析、概念构思。Lu-Lu Chen：撰写——审稿与
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
本研究得到了国家自然科学基金（项目编号：32371318和32071404）的支持。
