本综述概述了当前用于细胞疗法的免疫细胞分离技术。我们将探讨密度梯度离心法、MACS和FACS等方法，并讨论它们的优势和局限性。细胞富集（增加目标群体的相对丰度）与细胞分选（基于多参数分析精确分离特定亚群体，通常能达到非常高的纯度）之间存在显著区别。文中将重点介绍用于治疗的几种关键免疫细胞类型，包括T淋巴细胞、NK细胞、B细胞、单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞，并提供具体的实验方案和研究。同时，我们还将讨论分离后的细胞表征以及关键质量属性（CQAs）和评估方法。最后，我们还将探讨免疫细胞分离的未来方向和新兴技术，并提供比较各种技术及其应用的总结表。
基于细胞的免疫疗法是肿瘤学和再生医学中的革命性方法，它利用免疫系统的精确性来特异性地靶向癌症。嵌合抗原受体（CAR）-T细胞疗法在治疗难治性血液系统恶性肿瘤方面的临床成功——在B细胞急性淋巴细胞白血病中实现了40-90%的缓解率——验证了“活药物”的概念（Groth等人，2025年）。这些疗法是从患者体内通过白细胞分离得到的免疫细胞开始开发的，在体外进行工程改造后重新输回患者体内（Groth等人，2025年）。除了CAR-T细胞外，现有的疗法还包括自然杀伤（NK）细胞疗法。这些疗法利用NK细胞天然的、不受主要组织相容性复合体（MHC）限制的细胞毒性，使其适用于“即用型”应用，并降低了移植物抗宿主病（GvHD）的风险（Groth等人，2025年；Dan和Kang-Zheng，2025年；Peltier等人，2025年；Hadiloo等人，2023年）。此外，肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）疗法最近获得了FDA的批准，用于晚期黑色素瘤治疗，产品名为lifileucel（Iovance Biotherapeutics）；值得注意的是，这是首个获批准的TIL产品，它来源于切除的肿瘤标本（Groth等人，2025年；Stoops等人，2025年）。其他创新还包括工程化的巨噬细胞（CAR-M）和树突状细胞（DC）疫苗，它们分别通过改变肿瘤微环境来刺激抗肿瘤免疫（Groth等人，2025年；Wang等人，2022a）。然而，当CAR-T疗法用于实体瘤时，会遇到免疫抑制微环境、抗原异质性和细胞因子释放综合征（CRS）等不良效应的挑战（Groth等人，2025年；Esmaeilzadeh等人，2025年）。此外，针对组织驻留记忆T细胞的新疗法在以组织特异性方式分离这些细胞方面也存在困难（Stoops等人，2025年）。细胞疗法平台的多样化凸显了标准化、可扩展制造过程的迫切需求，因为高质量的细胞分离对于确保产品一致性和临床疗效至关重要（Wang等人，2022a；Shillingford等人，2025年）。
免疫细胞分离是治疗生产中的关键步骤，因为它决定了产品的安全性、效力和合规性。在CAR-T细胞生产中，实现高纯度的分离至关重要；例如，残留的单核细胞（超过2%）会通过分泌前列腺素E?抑制T细胞的扩增（Groth等人，2025年），而B细胞杂质可能导致溶血反应，在B细胞恶性肿瘤的情况下，还可能使白血病B细胞发生转导，从而导致产品污染（Shillingford等人，2025年；Atre和Reid，2025年）。在异基因NK细胞疗法中，即使仅有0.1%的T细胞污染也可能导致致命的GvHD（Groth等人，2025年；Dan和Kang-Zheng，2025年；Peltier等人，2025年）。分离技术必须确保细胞的活力和功能得以保留。荧光激活细胞分选（FACS）等过程中产生的机械应力主要与剪切应力引起的细胞死亡有关；然而，在分选过程中受体结合和激活信号也可能导致激活诱导的细胞死亡（AICD）和表面受体表达的改变。同样，抗体介导的选择可能会无意中激活T细胞，导致其耗竭。酶消化还可能降解重要的归巢受体，如组织驻留T细胞上的CXCR3（Stoops等人，2025年；Shillingford等人，2025年）。分离效果不佳可能会带来严重的后果。例如，通过酶法分离的肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）可能表现出较低的细胞毒性（Stoops等人，2025年），而通过黏附纯化的单核细胞则可能导致树突状细胞分化受损（Matsushita等人，2007年）。因此，在选择分离技术（如密度梯度离心法、磁激活细胞分选（MACS）或FACS）时，必须在纯度、产量、活力和功能保留之间取得平衡，并遵守GMP标准。在这种情况下，高通量方法如MACS通常用于初步富集细胞群体，而FACS则用于精确分选特定的、往往稀有的亚群体，以用于分析或关键的生产过程。新兴的解决方案，如封闭式自动化MACS系统，提高了重复性，同时确保符合监管标准（Shillingford等人，2025年）。
免疫细胞分离技术
从外周血和骨髓等复杂来源中分离出特定、存活且功能完整的免疫细胞对于确保细胞疗法的生产效果和安全性至关重要。所使用的分离技术直接影响最终产品的纯度、产量、活力和功能完整性。需要区分两种基本类型的细胞分离过程：富集（分离）和分选。
T淋巴细胞分离：策略和临床优化
为B细胞急性淋巴细胞白血病（B-ALL）患者生产自体CAR-T细胞的第一步也是最重要的一步是从白细胞分离产物中特异性富集T淋巴细胞。这一步骤对于最小化无意中用CAR构建体转导残留的白血病B细胞的风险至关重要，因为这可能导致CAR表达的肿瘤细胞的形成（Atre和Reid，2025年）。用于这种富集的方法已经不断发展。
关键质量属性（CQAs）和基因组安全性评估
对免疫细胞产品进行全面表征对于确保细胞疗法的安全性、有效性和一致性至关重要。关键质量属性（CQAs）是直接影响产品性能的可测量指标。基因修饰疗法需要特别关注转导效率和载体拷贝数（VCN）。转导效率通常通过流式细胞术或分子方法进行量化，表示被转导的细胞百分比。
技术和制造障碍
各种因素显著影响细胞疗法的产品质量、一致性和临床可扩展性。一个主要的技术障碍是在整个分离过程中保持细胞的活力和功能完整性。物理应力，如在FACS（荧光激活细胞分选）过程中经历的剪切力、MACS（磁激活细胞分选）过程中的机械操作，以及暴露于抗体或密度梯度介质中，都可能损害细胞膜完整性。
CAR-T细胞生产——定义起始T细胞群体
自体CAR-T细胞的生产对白细胞分离产品的组成非常敏感。特别是，起始材料中高水平的单核细胞（CD14+）或CD4+CD25+ Tregs会显著影响T细胞的激活和基因转移。例如，研究表明，去除CD14+单核细胞（这些细胞会吞噬抗CD3/CD28激活珠子，从而限制T细胞刺激）可以将早期激活水平提高一倍，并将CAR转导效率提高多达60%（Ayala等人）。
未来方向和建议
通过技术创新、改进的表征方法和标准化的制造过程，免疫细胞分离在细胞疗法领域的前景充满希望。这些发展旨在克服当前的限制，满足日益增长的临床需求。下一代分离技术专注于封闭系统、自动化平台，以减少手动操作，降低污染风险，并提高过程一致性。
结论
本综述表明，高保真的免疫细胞分离是有效细胞疗法的基础，技术选择直接决定了产品的安全性、效力和临床转化能力。虽然密度离心法、MACS和FACS等成熟方法提供了可靠的分离框架，但它们仍面临挑战，包括抗体介导的激活导致的功能下降、可扩展性限制以及物种间的差异。新兴技术有望解决这些问题。
资金披露
本研究未获得公共部门、商业部门或非营利组织的任何特定资助。
伦理合规性
作为对已发表文献的全面分析，本综述不需要进行涉及人类或动物的原始研究，因此无需机构伦理委员会的批准。
AI辅助披露
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CRediT作者贡献声明
马苏德·哈桑扎德·马库伊（Masoud Hassanzadeh Makoui）：撰写——审阅与编辑、初稿撰写、可视化、验证、调查、数据整理、概念化。阿米尔·巴亚特·博达吉（Amir Bayat Bodaghi）：初稿撰写、调查。穆罕默德·阿明·拉扎维（Mohammad Amin Razavi）：初稿撰写、调查。阿尔曼·塔兰（Arman Taran）：初稿撰写、调查。阿米尔·普亚·阿克巴里（Amir Pooya Akbari）：初稿撰写、调查。穆罕默德·巴赫拉米（Mohammad Bahrami）：初稿撰写、调查。阿卜杜勒雷扎·埃斯梅伊尔扎德（Abdolreza Esmaeilzadeh）：审阅。
利益冲突声明
所有作者声明没有财务或非财务利益冲突。
致谢
作者对所有在免疫细胞分离技术和表征方法方面做出开创性工作的研究人员表示衷心的感谢。
