《Journal of Oral Biology and Craniofacial Research》：Ovine bone graft enhances osteogenic commitment in human osteoblasts via selective suppression of miR-6797-5p: In silico and in vitro study
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为解决异种骨移植生物活性机制不清的问题，研究人员探讨了绵羊骨来源的可溶性因子是否通过调控RUNX2相关miRNA影响人成骨前体细胞的成骨向分化。研究发现绵羊骨条件培养基（OBG-CM）选择性抑制miR-6797-5p等miRNA的表达，解除其对RUNX2的转录后抑制，从而促进成骨相关基因表达。这为设计具有转录后调控活性的生物活性骨移植物提供了新见解。
在当代口腔颌面康复治疗中，骨增量技术至关重要。自体骨移植虽然是“金标准”，但来源有限且会造成供区损伤。因此，异种骨移植（如牛、猪骨来源）作为骨传导支架或成骨信号载体，被广泛应用。然而，除了物理的骨传导作用，这些生物材料与人体细胞之间的“对话”——它们如何通过复杂的分子信号来引导和促进新骨形成——仍然充满了未知。
其中，成骨细胞分化（osteoblast differentiation）的核心转录因子RUNX2，其活性受到一整套复杂的分子网络的精密调控，而微RNA（microRNA, miRNA）就是这个网络中至关重要的“微调开关”。现有的研究对牛、猪骨移植材料关注较多，但对另一种潜在来源——绵羊骨移植材料知之甚少。绵羊骨来源的羟基磷灰石（Hydroxyapatite, HA）因其理化性质的可调性，以及与人类骨骼在矿物质成分和重塑动力学上的相似性，正受到越来越多的关注。一个关键的科学问题随之浮现：绵羊骨移植材料释放的可溶性因子，能否重塑成骨前体细胞中与RUNX2相关的miRNA谱系，从而影响其向成骨细胞分化的“承诺”呢？这项发表在《Journal of Oral Biology and Craniofacial Research》的研究，正是为了解开这个谜团。
为了解答上述问题，研究人员采用了以下关键技术方法：首先，通过生物信息学分析（利用miRDB和STarMir数据库）预测与RUNX2结合的候选miRNA，并用Venny软件进行重叠筛选；其次，从绵羊股骨中分离制备羟基磷灰石（HA），并用其制备条件培养基（OBG-CM）用于处理人成骨前体细胞；最后，利用实时定量PCR（qRT-PCR）检测miRNA及RUNX2的mRNA表达，Western Blot检测RUNX2蛋白水平，并通过转染miRNA模拟物（mimic）和抑制剂（inhibitor）进行功能验证。
研究结果
3.1. 通过计算机预测识别靶向RUNX2的miRNA
研究人员首先运用生物信息学工具筛选可能靶向RUNX2基因3′非翻译区（3′UTR）的miRNA。通过比对miRDB和STarMir两个独立数据库的预测结果，他们鉴定出一个包含136个重叠候选miRNA的高置信度集合。通过设定LogitProb分数>0.8的门槛，进一步筛选出排名前15的候选miRNA，其中包括了hsa-miR-4455、hsa-miR-5703以及本研究的后续焦点hsa-miR-6797-5p。这些筛选结果为后续实验验证提供了目标。这一过程的总结可见于图1的维恩图和高分miRNA列表。
3.2. 成骨细胞暴露于绵羊骨移植条件培养基后的候选miRNA表达
为了探索绵羊骨移植物来源的可溶性因子是否影响RUNX2靶向miRNA，研究团队用OBG-CM处理人成骨细胞24小时，并检测了一组高置信度候选miRNA的表达。结果显示，这些miRNA的表达水平与未处理的对照组相比，仅有轻微波动，未呈现统计学上的显著变化。这表明短期暴露于OBG-CM并未对这些候选miRNA的表达造成显著扰动。
3.3. 绵羊骨移植条件培养基对RUNX2靶向miRNA的差异性调控
为了更全面地评估OBG-CM的调控效应，研究人员检测了另一组高置信度的RUNX2靶向miRNA。研究发现，绝大多数被检测的miRNA，如hsa-miR-4776-3p，其表达模式与对照组基本一致。然而，有三个miRNA的表现截然不同：hsa-miR-122-5p、hsa-miR-889-5p和hsa-miR-6797-5p。这三者在OBG-CM处理后均表现出明显的下调，其中hsa-miR-122-5p达到统计学显著性，而hsa-miR-6797-5p和hsa-miR-889-5p的表达水平甚至降至对照组的一半以下。由于它们都是RUNX2的预测抑制因子，其表达下调意味着可能解除了对RUNX2的抑制。这一选择性调控效应，而非全局性影响，提示OBG-CM可能通过精细重塑miRNA谱来促进成骨分化。
3.4. 验证hsa-miR-6797-5p作为RUNX2的调控因子
研究团队在人间充质干细胞（MSCs）中进一步验证了上述发现。结果显示，OBG-CM处理能显著下调hsa-miR-6797-5p的表达，而hsa-miR-122-5p和hsa-miR-889-5p的变化则不显著。这表明hsa-miR-6797-5p是对绵羊骨移植物来源因子反应最敏感的候选miRNA之一。为了阐明其作用机制，研究人员利用TargetScan工具进行靶点分析，发现hsa-miR-6797-5p与RUNX2的3′UTR区域（位置2591–2598）存在一个高度保守且高置信度的8聚体种子区配对。这从理论上支持了hsa-miR-6797-5p是RUNX2的直接转录后调控因子。
3.5. hsa-miR-6797-5p调控RUNX2表达的功能验证
为了直接证实hsa-miR-6797-5p对RUNX2的功能性调控作用，研究人员在人成骨细胞中转染了hsa-miR-6797-5p的模拟物或抑制剂。功能实验结果显示，转染模拟物后，RUNX2的mRNA和蛋白表达水平均显著降低；相反，转染抑制剂后，RUNX2的表达则被显著上调。这一正反两方面的证据，确凿无疑地证明了hsa-miR-6797-5p是RUNX2的负向调控因子。因此，OBG-CM引起的hsa-miR-6797-5p下调，很可能通过解除其对RUNX2的抑制，从而促进成骨相关基因的表达。这些结论得到了图5中qRT-PCR和Western Blot结果的支持。
3.6. 与RUNX2靶向miRNA相关的转录因子调控网络
为了深入理解这些miRNA在更广泛的转录调控网络中的作用，研究人员利用RegNetwork平台构建了相关的转录因子（Transcription Factor, TF）调控网络。分析发现，hsa-miR-122-5p等miRNA与SP1、NF-κB、HIF1A、FOXA1/2、STAT2等转录因子存在广泛的调控联系。这表明这些RUNX2靶向miRNA并非孤立存在，而是嵌入在复杂的转录调控回路中，可能与骨形成、炎症应激等多种信号通路相互交织。这进一步说明，OBG-CM诱导的miRNA变化，可能通过影响这些关键的转录节点，间接调控成骨分化过程。
结论与讨论
本研究旨在探索绵羊骨移植材料如何通过分子机制影响成骨前体细胞的命运。结论性地表明，绵羊骨移植物来源的可溶性因子，特别是其制备的条件培养基（OBG-CM），能够选择性地重塑成骨前体细胞中的miRNA图谱。其中，hsa-miR-6797-5p被确定为这一过程的关键调节因子。它在OBG-CM处理后被显著抑制，而功能实验证实其直接靶向并负向调控成骨分化核心转录因子RUNX2。因此，OBG-CM通过下调hsa-miR-6797-5p，解除了其对RUNX2的转录后抑制，从而为成骨基因的激活创造了一个有利的微环境。这一发现为理解异种骨移植材料的生物活性提供了一个新的分子视角。
研究的讨论部分将这一发现置于更广阔的领域背景中。众多研究表明，如miR-30a-5p、miR-468-3p等miRNA通过靶向RUNX2来抑制成骨分化。本研究发现并验证的hsa-miR-6797-5p，与Arumugam等人关于甲状旁腺激素（Parathyroid Hormone, PTH）调控的研究相呼应，进一步证实了其在RUNX2调控网络中的重要性。此外，转录因子网络分析揭示，这些被调控的miRNA与NF-κB、SMADs、FOX蛋白等关键通路节点相连，提示绵羊骨移植物的作用可能触及更深层次的信号交叉对话。
研究的重要意义在于，它将异种骨移植材料从单纯的物理“脚手架”角色，提升到了一个能够主动进行“细胞编程”的高度。通过揭示其通过选择性调控特定miRNA（尤其是hsa-miR-6797-5p）来促进RUNX2表达和成骨向分化的新机制，本研究为未来开发具有“智能化”转录后调控能力的生物活性骨移植材料奠定了理论基础。这预示着，未来的骨修复材料不仅需要考虑其结构特性，还可以被设计成能够精确调控宿主细胞特定分子通路的新型治疗剂，从而优化口腔颌面部乃至全身骨再生的临床效果。当然，研究也存在局限性，如未鉴定出OBG-CM中具体的活性分子成分，以及需要在更复杂的体内模型中验证。这些都为未来的研究指明了方向。
