肌萎缩侧索硬化症（ALS）是一种危及生命的神经系统疾病，其特征是大脑和脊髓中的运动神经元逐渐丧失，导致肌肉力量减弱、活动能力下降，最终引发呼吸系统衰竭（Morris, 2015; Nijssen et al., 2017）。该疾病会破坏自主肌肉控制，影响运动、言语和吞咽功能。虽然确切病因尚不清楚，但遗传突变（如SOD1和C9orf72）与环境因素共同参与了其发病机制。目前尚无治愈方法；然而，如利鲁唑（riluzole）和依达拉酮（edaravone）等疾病修饰疗法可以适度减缓疾病进展（Kushwaha et al., 2024; Nemeth et al., 2024）。康复策略（如物理治疗和辅助设备）对于改善患者的整体状况和日常生活功能至关重要。尽管如此，ALS仍不可避免地会导致死亡，呼吸衰竭通常是主要死因，通常在诊断后3-5年内发生（Murray et al., 2010; Ragagnin et al., 2019）。
苯丁酸钠（NaPB，图1a）是一种经FDA批准的口服药物，主要用于治疗尿素循环障碍（UCDs）。它通过清除体内多余的氨起作用，在肝脏中代谢为苯乙酸，后者与谷氨酰胺结合生成苯乙酰谷氨酰胺，该化合物通过尿液排出体外，有助于降低血液中的氨水平（Iannitti and Palmieri, 2011; Pe?a-Quintana et al., 2017）。对于UCD患者而言，这一机制至关重要，因为氮清除缺陷可能导致严重的神经毒性。除了代谢作用外，NaPB还被研究其在神经退行性疾病、癌症和囊性纤维化中的治疗潜力。作为组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制剂，它具有调节细胞应激反应的表观遗传调控作用。在ALS和阿尔茨海默病中，NaPB通过减轻内质网（ER）应激和促进蛋白质稳态表现出神经保护作用。此外，在囊性纤维化中，它还被研究用于通过稳定有缺陷的CFTR蛋白来纠正蛋白质错误折叠（Cudkowicz et al., 2009; Juarez et al., 2024; Paganoni et al., 2020）。
牛磺尿苷醇（TRS，图1b）是一种牛磺酸衍生的胆汁酸，因其神经保护作用而受到关注。最初用于治疗肝胆疾病，TRS通过稳定线粒体、减少内质网应激和抑制细胞凋亡发挥细胞保护作用。这些机制在ALS中尤为重要，因为神经元存活受到氧化应激和有毒蛋白质聚集的影响。临床前和临床研究表明，TRS可以保护运动神经元功能，从而延缓疾病进展（Khalaf et al., 2022）。
TRS与NaPB的组合（商品名Relyvrio）已获得FDA批准用于ALS治疗，这是一种有前景的治疗策略（Alqallaf et al., 2024; Ketabforoush et al., 2024）。这种双药方案强调了需要强大的分析方法，能够同时定量生物基质中的多种分析物，从而促进治疗监测和法规合规性的药代动力学和生物等效性评估。
尽管已有几种使用高效液相色谱（HPLC）和超高效液相色谱（UPLC）的技术用于单独或联合其他化合物测定NaPB和TRS，但专门针对这两种物质同时测定的方法仍然有限。Beludari等人（2024）开发了一种UPLC方法，用于同时定量批量和剂型中的NaPB和TRS。色谱分离在Waters C18柱（150 × 4.6 mm, 2 μm）上进行，流动相由磷酸盐缓冲液（pH 2.5）和甲醇以45:65（体积比）组成，流速为1.0 mL/min。检测在285 nm处进行，使用光电二极管阵列（PDA）检测器，注射体积为10 μL，柱温保持在30°C。NaPB和TRS的洗脱时间分别为1.483分钟和2.492分钟。在567–1701 μg/mL范围内建立了NaPB的线性，在189–567 μg/mL范围内建立了TRS的线性（Beludari et al., 2024）。
类似地，Raju等人（2025）报道了一种用于批量和剂型中NaPB和TRS同时分析的稳定性指示UPLC方法。色谱分离在Acquity UPLC BEH Shield RP-18柱（50 × 1.0 mm, 1.7 μm）上进行，流动相为乙腈和0.1%高氯酸（20:80，体积比），流速为0.5 mL/min。检测在287 nm处进行，使用PDA检测器，注射体积为5 μL，柱温为25°C。NaPB的保留时间为0.522分钟，TRS的保留时间为1.311分钟。在75–450 μg/mL范围内建立了NaPB的线性，在25–150 μg/mL范围内建立了TRS的线性（Raju et al., 2025）。尽管取得了这些进展，但目前尚未有针对生物基质（如大鼠血浆）中NaPB和TRS同时测定的验证方法。为解决这一分析空白，我们开发并验证了一种新型、高选择性和稳健的LC–MS/MS方法，用于同时定量大鼠血浆中的NaPB、TRS和内标牛磺胆酸（TCA，图1c）。该方法为评估生物利用度、生物等效性和潜在的药物相互作用提供了可靠的平台，适用于临床前和临床药代动力学研究。
除了分析贡献外，本研究还体现了绿色分析化学的理念，促进制药测试中的环境责任实践。使用多种互补工具（如Complementary Green Analytical Procedure Index (ComplexGAPI)、Analytical GREEnness metric (AGREE)、AGREEprep和Eco-Scale Analytical (ESA)评估（Jurisch et al., 2024; Yin et al., 2024））全面评估了所提出的LC-MS/MS方法的可持续性。为了进一步确定该方法的应用范围和实际可行性，还采用了Blue Applicability Grade Index (BAGI)，反映了White Analytical Chemistry (WAC)范式下的“绿色”方面。通过这种综合评估，研究不仅展示了强大的分析能力，还强化了对分析科学生态责任和可持续创新的承诺。
