《Journal of Structural Biology》：“QuickStainer”: a rapid negative staining device for improved preservation of molecular structure
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快速负染色装置（QuickStainer）通过3D打印组件和步进电机精确控制孵育时间（低至10ms），解决不稳定蛋白如肌动蛋白相互作用头（IHM）在载网表面失活问题，提升电镜下结构保真度至20?分辨率，未来可优化孵育时间和设备配置。
Vu Nguyen | Ruchi Gautam | Arun Kumar Somavarapu | Debabrata Dutta | Aditya Patra | Jinghua Ge | Christopher M. Yengo | Raúl Padrón | Roger Craig
马萨诸塞大学Chan医学院放射学系细胞生物学与成像科，美国马萨诸塞州伍斯特市
摘要
负染色是一种广泛用于透射电子显微镜观察大分子及其组装体的技术。它通常用于优化样品以适应冷冻电镜（cryo-EM）的使用。所使用的染料通常是铀酰盐，这种染料会包围分子结构，提供大约20埃分辨率的轮廓视图。许多大分子相对稳定且刚性较强，因此负染色图像能够很好地呈现它们的结构。然而，有些大分子较为不稳定或具有柔韧性，在染色前与网格上的碳基底结合会导致其结构或组装状态发生变化。在这种情况下，负染色后的外观并不能真实反映它们在溶液中的状态。通过将样品在碳表面上短时间（5秒）而非典型时间（30-60秒）内孵育，可以减少这种问题。为了将干扰降到最低，我们开发了一种快速负染色装置（QuickStainer），该装置采用3D打印组件、步进电机进行精确定时运动，并通过Arduino控制的界面执行指令。QuickStainer能够在染色前实现低至10毫秒的稳定孵育时间。测试表明，与标准制备方案相比，该装置能够快速使分子附着在网格上，并显著改善不稳定样品的结构保存效果。QuickStainer的设计还可以加入额外的步骤，例如在染色前与酶基底进行定时孵育。
引言
负染色是一种广泛用于透射电子显微镜（TEM）观察大分子的技术（Brenner和Horne, 1959; Huxley和Zubay, 1961; Ohi等人, 2004; Craig, 2012; Burgess等人, 2004; Booth等人, 2011; Scarff等人, 2018）。虽然冷冻电镜（cryo-EM）最近已成为高分辨率结构分析的首选方法（Kuhlbrandt, 2014），但负染色在优化冷冻电镜样品以及为不需要高分辨率的问题提供快速且经济的解决方案方面仍起着重要作用。该技术通常包括将样品（蛋白质复合物或单个分子）悬浮在水溶液中后涂覆在碳涂层网格上，等待30-60秒使其附着在碳上，然后再用重金属盐溶液进行染色（Booth等人, 2011; Scarff等人, 2018）。最常用的染料是铀酰盐（通常是醋酸铀酰或甲酸铀酰），它们能够在10毫秒内“固定”样品（Zhao和Craig, 2003）。去除多余的染料后，网格会经过等离子体处理以使其表面亲水，从而有助于染料的均匀分布。通过TEM观察的干燥网格会显示被染料包围的大分子图像，分辨率为约20埃。由于染料与蛋白质的结合力通常较弱，因此这种技术被称为“负染色”。
许多蛋白质、复合物和组装体（例如病毒）相对稳定且刚性较强，负染色能够很好地呈现它们在溶液中的结构。然而，另一些由弱相互作用维持的组装体则非常不稳定，其结构容易因与碳基底的结合而受到干扰，尤其是当碳基底经过等离子体处理后带电时（Ohi等人, 2004; Burgess等人, 2004; Scarff等人, 2018; De Carlo和Harris, 2011）。因此，它们的外观可能无法真实反映在溶液中的结构（图1a-c）。我们实验室的研究对象包括肌球蛋白分子和纤维（Craig, 2012; Rasicci等人, 2022）——这些高度柔韧的蛋白质和组装体容易因与带电基底的结合而发生结构破坏（Burgess等人, 2004; Scarff等人, 2018; Rasicci等人, 2022; Trinick和Elliott, 1979; Trinick和Elliott, 1982; Knight和Trinick, 1984; Walker等人, 1985; Burgess等人, 2007）。我们特别关注由肌球蛋白II形成的一个结构基序，其中肌球蛋白的两个头部会折叠回尾部并相互作用，形成相互作用头部基序（IHM，图1e）（Alamo等人, 2008）。这种“关闭”构象在细胞骨架中的肌球蛋白分子以及松弛肌肉的粗纤维中存在（Burgess等人, 2007; Wendt等人, 2001; Jung等人, 2008; Jung等人, 2008; Lee等人, 2018; Alamo等人, 2017）。当肌球蛋白被激活或环境条件改变（例如离子强度增加）时，这种构象会转变为“开放”构象，此时头部不再相互作用或与尾部相互作用（图1e）（Craig等人, 1983; Trybus和Lowey, 1984; Lowey等人, 1969）。在研究心脏肌球蛋白II的IHM结构时，我们发现使用负染色技术时，很少有或根本没有分子显示关闭构象，而根据其他溶液技术大多数分子应该是关闭的（Rasicci等人, 2022）；相反，大多数分子呈现开放构象。其他人也遇到了类似问题，即使是来自平滑肌肌球蛋白的更稳定的IHM结构（Burgess等人, 2007）。通过缩短样品在网格上的孵育时间，这一问题得到了改善，从而增加了关闭结构的数量，这表明问题可能出在样品与网格表面的相互作用上（Burgess等人, 2007）。为了进一步验证这一观点，我们将心脏肌球蛋白构建体的孵育时间从30秒缩短到5秒，虽然大多数分子仍然保持开放状态（Rasicci等人, 2022）。手动实现短孵育时间很困难且不可重复，实际操作中很难将时间控制在5秒以下。因此，我们设计并制造了一种基于计算机控制的旋转步进电机的快速自动化负染色装置，将孵育时间缩短到不到一秒。使用该装置（QuickStainer）可以实现极短的染色时间（低至10毫秒），显著提高了关闭IHM结构的保存效果（图1d）。该装置易于制造，对于研究多种不稳定的蛋白质和复合物非常有用。
腺相关病毒（AAV9873）由UMass Chan医学院电子显微镜设施提供，脱铁蛋白（apoferritin）从Sigma-Aldrich公司获得（目录编号A3660），心脏肌球蛋白构建体的制备方法参照Rasicci等人（2022）的研究，平滑肌肌球蛋白由Ikebe博士提供，制备方法参照Ikebe和Hartshorne（1985）的研究。
碳涂层网格由EMS公司（CF-400-Cu-50）提供。这些网格在PELCO easiGlo等离子体放电装置中以15毫安的电流放电处理25秒。
QuickStainer的工作原理是限制样品在等离子体放电碳表面的孵育时间，以减少表面引起的样品结构破坏。一旦样品接触到用于负染色的铀酰盐（通常是醋酸铀酰或甲酸铀酰），它会在10毫秒内被固定，结构不再发生变化（Zhao和Craig, 2003）。手动染色的典型孵育时间为30-60秒（Booth等人, 2011; Scarff等人, 2018）。
不稳定的蛋白质和大分子组装体在应用于带电的电子显微镜网格进行负染色时容易发生结构破坏，导致对其在溶液中的结构产生错误解读；类似的问题也出现在阴影效应中（molecules附着在带电云母表面），以及在冷冻电镜中（颗粒在空气-水界面变性，Noble等人, 2018）。我们发现QuickStainer通过最小化样品与网格的接触时间大大减少了这一问题。
QuickStainer还有多种改进空间。例如，可以将支撑样品和染料的支柱之间的距离缩短（例如当前距离的一半），使用更快的电机，将孵育时间缩短到10毫秒以下，并增加关闭的IHM结构的数量（参见图4）。在最短孵育时间内，限制因素可能是获得足够颗粒分布所需的蛋白质浓度。随着孵育时间的进一步缩短，
Vu Nguyen：撰写 – 审稿与编辑、方法学、研究、概念化。Ruchi Gautam：撰写 – 审稿与编辑、可视化、方法学、研究、形式分析、概念化。Arun Kumar Somavarapu：撰写 – 审稿与编辑、方法学、研究、概念化。Debabrata Dutta：撰写 – 审稿与编辑、概念化。Aditya Patra：撰写 – 审稿与编辑、方法学、研究。Jinghua Ge：撰写 – 审稿与编辑、研究。
作者们没有需要披露的相关财务或非财务利益。
本工作以初步形式在Nguyen等人（2024）的研究中进行了展示。我们感谢UMass Chan医学院电子显微镜设施的Greg Hendricks博士和Kyoung Hwan Lee博士在显微镜操作和培训方面的帮助，以及提供的AAV样本。同时感谢Ikebe博士和Sato Osamu博士提供的平滑肌肌球蛋白。本研究得到了美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）的资助，资助编号为HL164560、AR081941、HL163585和HL150953。内容仅代表作者本人的观点。
