《Aging Cell》：Acceleration of Lactate Uptake and Utilization Contributes to Neuroprotective Action of FGF21 Involved in Naturally Aging Mice
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本文发现，在自然衰老过程中，大脑神经元FGF21表达上调，通过p38 MAPK依赖机制响应氧化应激。外源性给予FGF21（1 mg/kg）可显著改善衰老或长期乳酸输注小鼠的学习记忆能力，其机制依赖于上调单羧酸转运蛋白2（MCT2）并激活PI3K-Akt-mTOR通路，从而加速星形胶质细胞-神经元乳酸穿梭（ANLS）速率，优化乳酸代谢微环境。研究首次揭示了FGF21调控脑内乳酸稳态的关键作用，为延缓衰老相关认知功能障碍提供了潜在治疗靶点。
1. 引言
衰老是一种不可避免的生物学过程，伴有生理认知功能（如学习记忆）的逐渐衰退。大脑衰老的特征是神经炎症和乳酸代谢变化。乳酸不仅是糖酵解的代谢产物，也是大脑中重要的能量底物和信号分子。星形胶质细胞-神经元乳酸穿梭（ANLS）假说认为，星形胶质细胞产生乳酸，然后将其转运至神经元，为其氧化代谢和突触活动供能。该代谢耦联的破坏与阿尔茨海默病（AD）和帕金森病（PD）等神经退行性疾病相关的认知障碍有关。成纤维细胞生长因子21（FGF21）主要由于肝脏和脂肪组织分泌，对糖脂代谢和衰老过程具有多效性作用。先前研究发现，FGF21治疗可改善糖尿病小鼠的学习记忆能力和乳酸摄取，并通过调节乳酸稳态改善PD小鼠的运动和认知功能障碍。然而，衰老环境中内源性FGF21与乳酸稳态之间的因果关系尚不清楚。
2. 方法
研究使用了雄性C57BL/6小鼠，分为2月龄（年轻对照）、20月龄（自然衰老）以及FGF21治疗的衰老小鼠。此外，还在野生型和羟基羧酸受体1敲除（HCA1-KO）小鼠中，结合衰老或长期乳酸输注，检测了MAPK信号和ANLS相关蛋白。使用Morris水迷宫和Y迷宫测试评估学习记忆能力。通过组织学分析、免疫荧光、Western blot、RT-PCR等技术检测了神经元丢失、炎症、氧化应激、凋亡标志物以及乳酸代谢相关蛋白的表达。建立了细胞衰老模型（使用H2O2处理）以验证体外机制。
3. 结果
3.1 自然衰老大脑中ANLS速率和FGF21水平升高
研究发现，与年轻小鼠相比，衰老小鼠海马和皮层区域的神经元数量减少，细胞凋亡增加，同时乳酸水平升高。糖酵解酶（HK， PFK， PK， PDK1）和三羧酸循环酶（CS， IDH2， OGDH）的mRNA水平在衰老小鼠中高表达，提示衰老大脑中乳酸产生和代谢增强。乳酸脱氢酶A（LDH-A，主要在星形胶质细胞）和B（LDH-B，主要在神经元）的mRNA和蛋白水平在衰老脑区均增加。同时，单羧酸转运蛋白2（MCT2）表达上调，表明衰老大脑中ANLS速率加快。有趣的是，衰老小鼠皮层和海马区域（而非肝脏组织）的FGF21蛋白水平显著升高，且免疫共定位显示FGF21主要来源于神经元（NeuN阳性）。这些结果表明，衰老小鼠中ANLS速率加快，并与大脑乳酸稳态的调节协同作用。
3.2 外源性FGF21给药改善衰老小鼠的学习记忆缺陷
给20月龄衰老小鼠连续28天腹腔注射外源性FGF21（1 mg/kg）后，小鼠体重显著降低。在Morris水迷宫测试中，与未治疗的衰老小鼠相比，FGF21治疗组表现出更短的逃避潜伏期、更多的平台穿越次数以及在目标象限停留时间更长，学习记忆能力得到改善。Nissl染色和NeuN染色结果显示，FGF21治疗减轻了衰老小鼠海马和皮层区域的神经元丢失。这些结果表明，FGF21能有效缓解衰老引起的认知障碍和神经元凋亡。
3.3 FGF21治疗与衰老大脑中MAPK信号抑制及ANLS相关蛋白上调相关
FGF21治疗显著降低了衰老小鼠海马和皮层中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）阳性细胞数量，改善了神经炎症。同时，FGF21逆转了衰老引起的皮层MAPK信号（JNK和p38磷酸化）激活、促氧化蛋白NADPH氧化酶1（NOX1）和促凋亡蛋白Bax、cleaved-caspase-3的表达升高，并恢复了抗氧化蛋白超氧化物歧化酶1/2（SOD1/2）和抗凋亡蛋白Bcl-2的水平。这表明FGF21通过降低JNK和p38 MAPK磷酸化及氧化应激通路来预防衰老诱导的神经元凋亡。此外，FGF21进一步增强了衰老大脑中PI3K和mTOR的磷酸化，以及MCT2、LDHA、LDHB的蛋白表达，表明FGF21以PI3K-mTOR依赖的方式驱动ANLS速率升高。通过在特定脑区立体定向注射腺病毒敲低FGF21表达，发现衰老小鼠的学习记忆能力受损，同时皮层c-Fos表达以及mTOR-PI3K信号和乳酸代谢转运蛋白水平部分降低，证实FGF21是乳酸代谢的上游调控因子。同样，敲低MCT2也损害了衰老小鼠的认知功能并逆转了ANLS相关蛋白水平，但不影响mTOR信号，表明MCT2是ANLS的上游因子。
3.4 FGF21给药挽救了长期乳酸暴露小鼠的MAPK信号和ANLS通路
通过连续90天输注乳酸，建立了乳酸蓄积、ANLS速率减弱的小鼠模型。FGF21治疗显著改善了乳酸输注小鼠在Y迷宫和Morris水迷宫中的表现，并恢复了皮层即刻早期基因（Arc， c-Fos）和突触蛋白（PSD95， SAP97）的水平。与衰老大脑中MAPK信号激活不同，长期乳酸暴露抑制了皮层细胞外信号调节激酶（ERK）、p38 MAPK和JNK的磷酸化，而FGF21治疗可恢复这些MAPK信号活性。同时，乳酸输注降低了AMP活化蛋白激酶（AMPK）磷酸化以及LDHA和LDHB水平，反映了生物能量水平和ANLS速率下降，FGF21治疗同样逆转了这些变化。重要的是，FGF21治疗显著增加了PI3K、Akt、mTOR磷酸化水平和MCT2蛋白表达，进一步证实PI3K-Akt-mTOR通路参与了FGF21对ANLS速率和MCT2表达的调控。
3.5 细胞外乳酸积累以HCA1依赖的方式减弱学习和记忆能力及MAPK信号活性
体外实验发现，外源性乳酸暴露以剂量依赖方式抑制原代神经元的乳酸摄取，MCT2沉默或其药理抑制剂（AR-C155858）也能抑制神经元的乳酸摄取。相反，在高糖环境中，原代星形胶质细胞（而非神经元）的乳酸释放率显著增加。这表明乳酸暴露通过MCT2依赖的方式显著抑制神经元对乳酸的摄取率，导致代谢微环境中细胞外乳酸积聚。羟基羧酸受体1（HCA1，又称GPR81）是一种主要在神经元质膜上表达的乳酸激活G蛋白偶联受体。研究发现，乳酸或其激动剂3，5-DHBA处理可降低原代神经元中磷酸化cAMP反应元件结合蛋白（pCREB）水平，而腺苷酸环化酶激活剂forskolin可逆转乳酸的抑制作用。在过表达HCA1的HEK293细胞中，乳酸处理降低了PKA和CREB的磷酸化水平。在长期乳酸输注的野生型（WT）小鼠中，观察到PKA-CREB信号活性被抑制，学习和记忆能力受损，而HCA1敲除（KO）小鼠则未出现这些变化。同时，乳酸处理WT小鼠（而非HCA1-KO小鼠）的Arc、c-Fos、PSD95、SAP97蛋白水平以及MAPK信号均降低。这些结果表明，HCA1-KO能显著消除乳酸积累小鼠中CREB和MAPK信号的抑制。然而，在衰老大脑中，FGF21、p-AMPK、MCT2和LDHB水平的升高在WT和HCA1-KO小鼠中均存在，表明衰老相关ANLS速率加快和FGF21水平升高独立于HCA1激活。因此，乳酸微环境在衰老大脑（ANLS速率加快）和乳酸暴露大脑（HCA1激活）中具有不同特征。
3.6 FGF21通过MCT2依赖的方式调节神经元乳酸摄取以对抗细胞衰老
通过尾静脉注射腺相关病毒PHP.eB（AAV-PHP.eB）在小鼠皮层过表达MCT2，结果完全逆转了乳酸输注引起的ERK、JNK、p38 MAPK磷酸化以及LDHA、LDHB水平的下降，模拟了FGF21在脑中的作用。在SH-SY5Y细胞中，乳酸和MCT2抑制剂（AR-C155858）处理降低了JNK和p38 MAPK磷酸化及LDHA/B水平，模拟了乳酸暴露的影响，而FGF21孵育则抵消了这些抑制作用，并增加了MCT2水平。这表明FGF21对神经元的治疗作用与神经元乳酸摄取和MCT2过表达有关。使用H2O2处理模拟细胞衰老，发现衰老神经元中FGF21表达上调，且此过程依赖于p38 MAPK（而非JNK或ERK）的激活。机制上，FGF21通过激活PI3K/Akt/mTOR信号通路上调MCT2表达，PI3K抑制剂（LY294002）或mTOR抑制剂（Rapamycin）可削弱FGF21对MCT2的诱导作用。
4. 讨论
衰老是阿尔茨海默病（AD）的重要风险因素，代谢功能障碍是其标志之一。本研究首次提供了FGF21与衰老大脑乳酸稳态相关的证据。FGF21具有多种抗衰老作用，包括减少神经元凋亡、保护免受氧化应激和减轻炎症衰老。研究结果表明，细胞外乳酸积累不利于神经元代谢和功能。因此，FGF21的抗AD样作用更依赖于加速乳酸摄取和利用，改善乳酸代谢微环境。在衰老大脑中，星形胶质细胞通过LDH-A产生更多乳酸，而神经元通过MCT2增强乳酸摄取能力，表明ANLS速率加快。这种加速的乳酸代谢可能是对衰老相关应激（如氧化应激）的补偿性保护反应。FGF21在衰老大脑中主要由神经元以p38 MAPK依赖的方式产生，并通过自分泌或旁分泌方式作用于PI3K-mTOR-MCT2轴，进一步促进乳酸利用。与长期直接乳酸暴露通过激活HCA1抑制CREB/MAPK信号通路不同，衰老大脑中的乳酸代谢变化是HCA1非依赖性的。研究提出，乳酸穿梭速率和代谢微环境与神经元功能和认知能力相关，而FGF21可以调控这一过程。靶向乳酸代谢可能是治疗AD等神经退行性疾病的新策略。
5. 结论
本研究阐明了FGF21在正常衰老和乳酸积累病理条件下调节代谢环境和乳酸利用的作用。结果表明，皮层神经元分泌的FGF21可通过激活PI3K-mTOR信号通路上调MCT2表达，从而加速ANLS速率，使神经元更有效地从乳酸中获取ATP，改善认知功能。研究首次提出乳酸穿梭速率和代谢微环境与神经元代谢和功能相关，并受FGF21调控。鉴于AD中存在乳酸代谢紊乱，靶向乳酸代谢可能成为治疗AD的新途径。
