《LWT》：Synergistic effects of dual-frequency ultrasound on
Stropharia rugosoannulata protein extraction: Mechanism unraveled through proteomics and physicochemical properties
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本文聚焦于替代蛋白质的可持续生产，针对单频超声提取真菌蛋白存在的能量分布不均及蛋白易聚集等问题，研究者采用多频率组合（23/25、23/28、23/40 kHz）的双频超声技术提取大球盖菇蛋白，并结合蛋白质组学和理化特性分析探究其增效机制。研究发现，双频超声可使蛋白质含量提升超过50%，且所获蛋白热稳定性更佳（变性温度达134.87–136.10 °C）、粒径更小（240.6–443.7 nm）。蛋白质组学分析揭示，双频超声能高效释放细胞内与遗传信息处理、中心碳代谢和氨基酸代谢相关的核心功能蛋白，并改变蛋白结构以抑制分子聚集。该研究从分子层面深化了对双频超声机制的理解，为生产高质量替代蛋白提供了理论依据。
随着全球人口增长，蛋白质需求持续攀升，开发资源高效、环境友好的蛋白质供给系统至关重要。食用菌作为一种高蛋白营养资源，成为替代蛋白的理想来源之一。然而，从真菌基质中高效、高质地提取蛋白质仍面临挑战。传统的单频超声辅助提取虽然快速、高效，但其能量分布不均形成的驻波场可能导致局部空化效应过强，进而引发蛋白质变性或过度聚集，影响蛋白的功能性质。为克服这些限制，双频超声技术应运而生，它通过同时或交替施加两种不同频率，产生协同效应，有望实现更均匀的能量分布和增强的空化效应。但其在蘑菇蛋白提取中的增效机制，尤其是分子层面的机理，仍不清晰。这项发表于《LWT - Food Science and Technology》的研究，正是为了深入探究双频超声提取大球盖菇蛋白的协同效应与分子机制。
本研究主要采用了以下几种关键技术方法：首先，利用定制的狭缝式超声波反应器，在固定功率密度、温度、料液比和间歇占空比条件下，分别进行了单频（23 kHz）和三种双频组合（23/25、23/28、23/40 kHz）的蛋白提取实验。其次，通过二辛可宁酸（BCA）法测定总蛋白含量，并分析了水解氨基酸组成。再者，运用差示扫描量热法（DSC）评估蛋白质热稳定性，通过圆二色谱（CD）分析蛋白质二级结构，并采用动态光散射（DLS）测定蛋白质溶液的流体动力学直径（即粒径）。最后，进行了全面的蛋白质组学分析，通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）技术鉴定和定量蛋白质，并使用主成分分析（PCA）、差异表达蛋白（DEPs）分析以及基于基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）数据库的功能注释与富集分析，从分子层面解析不同超声处理对提取蛋白谱的影响。
3.1. 蛋白质含量分析
通过BCA法测定发现，所有超声处理均显著提高了提取物中的蛋白质含量，而双频超声提取的效果尤为突出。其中，23/28 kHz处理组的蛋白质含量最高，超过60%。与单频超声相比，双频超声使蛋白质含量提升了13%–34%。
3.2. 蛋白质氨基酸组成分析
氨基酸分析显示，大球盖菇蛋白含有17种水解氨基酸，谱系完整。在所有处理中，23/28 kHz双频超声提取的样品总氨基酸含量和必需氨基酸含量均最高，分别达到25.69% ± 1.48%和10.52% ± 0.50%，与蛋白质含量结果一致。
3.3. 蛋白质热稳定性分析
差示扫描量热分析表明，双频超声提取的蛋白质变性温度范围在134.87 °C至136.10 °C之间，显著高于水提对照（100.14 °C）和单频超声提取（116.05 °C）的样品，显示出更优越的热稳定性。此外，双频超声提取物的热谱图中在41–58 °C间观察到一个吸热峰，提示样品中可能存在肽段，这可能是双频超声促进了蛋白质的有限水解或前体肽释放的结果。
3.4. 蛋白质二级结构分析
圆二色谱分析显示，超声处理显著改变了蛋白质的二级结构。与对照组相比，所有超声处理均增加了β-折叠和β-转角比例，降低了α-螺旋和无规则卷曲比例。单频超声处理形成了刚性有序的结构，β-折叠含量最高；而23/25 kHz和23/28 kHz双频处理则产生了更灵活、无序度更高的结构，无规则卷曲比例显著增加。这表明超声诱导蛋白质发生了从聚集态到解聚、伸展再到重组的结构重构过程。
3.5. 蛋白质粒径分析
动态光散射结果显示，单频超声提取的蛋白质粒径最大（1045.77 ± 49.54 nm），表明发生了显著的蛋白质聚集。相比之下，双频超声提取的蛋白质粒径显著减小（240.63–443.70 nm），且随着双频组合中第二频率的升高，粒径逐渐减小。这表明双频超声能有效解离蛋白质聚集体，使粒径分布向更小的尺寸移动。
3.6. 蛋白质组学分析
主成分分析表明，不同超声处理提取的蛋白质组在空间中明显分离，说明处理模式是导致提取蛋白质谱差异的主要因素。分子量分布显示，双频超声提取样品在所有分子量区段的蛋白数量均高于单频超声，证实了其更强的蛋白释放能力。
差异表达蛋白分析发现，在双频超声与单频超声的比较中，上调的DEPs数量超过1000个，而下调的DEPs少于100个。这728个共同上调的DEPs是研究的核心。GO功能注释显示，这些蛋白主要与含氮有机化合物代谢过程、核苷酸结合、ATP结合等分子功能相关。KEGG通路富集分析表明，这些DEPs显著富集于核糖体、剪接体、TCA循环（三羧酸循环）、丙酮酸代谢、糖酵解/糖异生、戊糖磷酸途径、氨基酸代谢等通路。具体来说，富集的蛋白包括葡萄糖-6-磷酸1-脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶[NADP]+、ATP依赖的6-磷酸果糖激酶、琥珀酰辅酶A连接酶等，它们是参与中心碳代谢、能量产生和生物合成的关键可溶性酶。此外，还鉴定出如热休克蛋白HSS1、H/ACA核糖核蛋白复合物亚基CBF5等应激反应和遗传信息调控相关蛋白。
研究在结论与讨论部分强调，本研究通过整合高分辨率蛋白质组学与全面的理化表征，从分子到功能层面阐明了双频超声的作用机制。研究发现，双频超声的增效机制在于其能更温和且彻底地破坏细胞器和细胞膜，从而高效、完整地释放细胞内负责中心代谢和遗传信息流的核心功能性蛋白质组，例如可溶性代谢酶和核糖体蛋白。同时，双频超声产生的更均匀、持续的剪切力避免了单频超声局部过强的机械力导致的严重蛋白质变性和疏水基团暴露，使得肽链能够重组成更灵活、分散的结构，有效抑制了蛋白质聚集体的形成，表现为更小的粒径和增强的热稳定性。在测试的三种双频组合中，23/28 kHz在蛋白质含量、氨基酸组成和形成灵活蛋白结构方面表现出最佳的综合性能，被认为是提取大球盖菇蛋白的优化频率窗口。该研究不仅揭示了双频超声在分子水平上的作用机理，还为利用该技术生产具有增强稳定性和更接近天然蛋白质组谱的高质量、功能性蛋白质配料提供了科学基础。所获得的蛋白质改善的热稳定性和良好的氨基酸组成，使其在营养保健品、药品和清洁标签食品应用中具有吸引力。未来的研究将致力于解决放大挑战，包括能源效率、反应器设计和工业转化的经济可行性，并评估长期储存稳定性和功能特性。这项研究为超声辅助提取提供了分子层面的深入理解，并支持可持续替代蛋白质的生产。
