《Materials Today Bio》：Nanomedicine based on collagenase penetration for tumor immunotherapy induced by low-dose chemotherapy
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本研究针对肿瘤微环境（TME）中致密的细胞外基质（ECM）阻碍纳米药物向实体瘤深部渗透、限制其疗效的关键问题，开发了一种共包封胶原酶-IV（COL）与化疗药物多西他赛（DTX）的牛血清白蛋白（BSA）纳米颗粒（COL/DTX@BSA NPs）。该“酶促渗透增强”策略有效破坏了肿瘤ECM屏障，促进了纳米药物的深度渗透，并利用低剂量DTX诱导免疫原性细胞死亡（ICD），激活了抗肿瘤免疫应答，在体内外模型中均展现出显著的抑瘤效果，为克服实体瘤治疗瓶颈提供了新思路。
在对抗癌症的漫长征程中，科学家们开发了多种强大的武器，但许多在临床试验中“折戟沉沙”。一个主要障碍隐藏在肿瘤内部——肿瘤微环境（Tumor Microenvironment, TME）。这个由肿瘤细胞及其周围的细胞、血管、信号分子以及致密的细胞外基质（Extracellular Matrix, ECM）构成的复杂“堡垒”，不仅为肿瘤生长提供了养分和支持，更形成了一个坚固的物理和生化屏障。特别是其中过度沉积和交联的胶原纤维，如同层层铁丝网，严重阻碍了治疗药物和免疫细胞向肿瘤核心区域的渗透和浸润，使得许多疗法只能在肿瘤外围“隔靴搔痒”，难以触及深部病灶。为了解决纳米药物因ECM屏障导致的渗透不足问题，并探索更安全有效的治疗策略，研究人员将目光投向了能够切割胶原的“分子剪刀”——胶原酶（Collagenase, COL），以及一种能够诱导特殊免疫激活的化疗药物。
这项发表于《Materials Today Bio》的研究，旨在开发一种集成了“破壁”与“激活”双重功能的智能纳米药物。研究人员利用牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin, BSA）作为载体，同时包封胶原酶-IV（COL）和化疗药物多西他赛（Docetaxel, DTX），构建了名为COL/DTX@BSA NPs的纳米颗粒。其核心策略是：首先，利用纳米颗粒的EPR效应（Enhanced Permeability and Retention effect，增强渗透和滞留效应）使其在肿瘤部位富集；随后，在肿瘤微环境中释放的COL像剪刀一样，精准地降解ECM中的胶原纤维，为纳米颗粒和药物开辟深入肿瘤内部的通道；最后，抵达深部肿瘤区域的低剂量DTX不仅直接杀死肿瘤细胞，更关键的是能诱导肿瘤细胞发生免疫原性细胞死亡（Immunogenic Cell Death, ICD），释放出钙网蛋白（Calreticulin, CRT）、高迁移率族蛋白B1（High-mobility group protein B1, HMGB1）和三磷酸腺苷（Adenosine Triphosphate, ATP）等损伤相关分子模式（Damage-Associated Molecular Patterns, DAMPs），从而像敲响“警钟”一样，激活树突状细胞（Dendritic Cells, DCs），进而启动强大的抗肿瘤免疫应答。这项研究最终证明，这种“酶促渗透增强+化疗-免疫协同”的策略，能够有效克服实体瘤的渗透屏障，实现低剂量化疗下的高效免疫激活，为治疗深部实体瘤提供了一种新颖且有前景的联合治疗方案。
为了验证这一设想，研究者们采用了多种关键技术方法。他们通过一步法合成制备了COL/DTX@BSA NPs，并使用透射电子显微镜（Transmission Electron Microscopy, TEM）和动态光散射（Dynamic Light Scattering, DLS）对其形貌、粒径和电位进行了表征。通过高效液相色谱（High-Performance Liquid Chromatography, HPLC）测定了药物包封率和载药量，并利用胶原酶活性测定试剂盒和圆二色光谱（Circular Dichroism, CD）评估了COL的活性和BSA结构的变化。在细胞和动物模型上，他们使用了小鼠乳腺癌细胞（4T1）构建了体外多细胞球体（Multicellular Spheroids, MCSs）模型和小鼠体内肿瘤模型，通过共聚焦激光扫描显微镜（Confocal Laser Scanning Microscopy, CLSM）和小动物活体成像技术，评估了纳米颗粒在体外和体内的渗透与分布情况。利用CCK-8法和流式细胞术检测了纳米颗粒对肿瘤细胞的杀伤和促凋亡作用。通过CLSM观察和ATP检测试剂盒，评估了DTX诱导ICD的标志物（CRT外翻、HMGB1外排和ATP释放）。从小鼠骨髓中提取并诱导了骨髓来源的树突状细胞（Bone Marrow-Derived Dendritic Cells, BMDCs），通过流式细胞术检测其成熟标志物（CD80、CD86）的表达。最后，在小鼠双侧肿瘤模型（使用B16F10黑色素瘤细胞）中，通过监测肿瘤生长、记录生存曲线，并结合流式细胞术分析肿瘤引流淋巴结（Tumor-Draining Lymph Nodes, tdLNs）、肿瘤和脾脏中各种免疫细胞（成熟DCs、CD8+T细胞、CD4+T细胞、髓源性抑制细胞Myeloid-Derived Suppressor Cells, MDSCs）的比例，以及使用酶联免疫吸附测定（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA）检测血清中细胞因子（TNF-α, IFN-γ, IL-12）水平，全面评估了纳米颗粒的体内抗肿瘤效果和免疫激活能力。
合成与表征COL/DTX@BSA NPs
研究人员成功制备了粒径均匀（约34.44 nm）、呈球形的COL/DTX@BSA NPs。表征结果显示，COL在纳米颗粒中保持了良好的酶活性，BSA的蛋白质二级结构在制备过程中未发生明显改变，表明该纳米系统具有良好的生物相容性和稳定性。溶血实验也证实了其良好的血液安全性。
COL/DTX@BSA NPs在体内外的渗透增强效应
在体外4T1多细胞球体模型中，荧光标记的COL/DTX@BSA NPs（C/D@B-FITC）展现了卓越的深度渗透能力，其荧光信号可贯穿整个球体（0-200 μm），而缺少COL的对照组（D@B-FITC）渗透能力有限。在4T1荷瘤小鼠体内，活体成像和离体器官荧光成像表明，C/D@B-Cy7 NPs在肿瘤部位的积累和滞留显著优于对照组。对肿瘤组织切片的免疫荧光染色进一步证实，COL/DTX@BSA NPs处理组肿瘤内的胶原纤维信号显著减弱，血管标志物CD31信号也降低，说明COL有效降解了ECM胶原，破坏了肿瘤血管，从而促进了纳米药物的深度渗透。
COL/DTX@BSA NPs的体外治疗效果
在二维细胞培养中，COL/DTX@BSA NPs对4T1细胞的半数抑制浓度（IC50）与DTX@BSA NPs相近。然而，在更能模拟实体瘤三维结构的4T1多细胞球体模型中，COL/DTX@BSA NPs展现出了显著优势：它能更有效地抑制球体生长、减少球体数量、并诱导更多的细胞凋亡。活/死细胞染色和Western blot检测凋亡关键蛋白cleaved caspase-3的结果均证实，COL的加入通过增强渗透，显著提升了DTX对深层肿瘤细胞的杀伤效果。
COL/DTX@BSA NPs的体外免疫激活能力
研究证实，DTX能够诱导肿瘤细胞发生ICD。CLSM观察和ATP检测显示，COL/DTX@BSA NPs处理组能有效促进CRT在细胞膜表面的暴露、HMGB1的释放以及ATP的分泌，这些都是ICD的关键标志。随后，将不同药物处理后的肿瘤细胞与小鼠BMDCs共培养，流式细胞术分析发现，COL/DTX@BSA NPs和DTX@BSA NPs均能显著促进DCs的成熟（高表达CD80和CD86），而单纯的COL@BSA NPs则无此效果。这证明了DTX诱导的ICD能够有效激活抗原提呈细胞。
COL/DTX@BSA NPs的体内治疗效果
在4T1荷瘤小鼠模型中，COL/DTX@BSA NPs治疗组表现出最强的肿瘤生长抑制效果，小鼠生存期显著延长，且对小鼠体重和主要器官功能无明显影响，显示出良好的体内安全性。肿瘤组织病理学分析（H&E染色）显示该组肿瘤细胞损伤最严重。免疫荧光染色也证实，该组肿瘤组织中CRT信号最强、HMGB1外排最多，表明其在体内同样能有效诱导ICD。
COL/DTX@BSA NPs对双侧肿瘤的抑制效应及免疫激活能力
为了评估纳米颗粒能否激发系统性抗肿瘤免疫，研究构建了B16F10小鼠双侧肿瘤模型。结果显示，COL/DTX@BSA NPs不仅能有效抑制原位（注射侧）肿瘤的生长，还能显著抑制远端（非注射侧）肿瘤的生长，并减少肝脏转移结节。这表明治疗激发了全身性的抗肿瘤免疫应答。深入的免疫学分析揭示了其机制：流式细胞术检测发现，COL/DTX@BSA NPs处理组小鼠的肿瘤引流淋巴结中成熟DCs比例最高；在原位和远端肿瘤以及脾脏中，细胞毒性T细胞（CD8+T细胞）和辅助性T细胞（CD4+T细胞）的浸润比例均显著增加，而免疫抑制性的MDSCs比例降低。同时，血清中促炎细胞因子TNF-α、IFN-γ和IL-12的水平也最高。这些数据综合表明，COL/DTX@BSA NPs通过诱导ICD，成功激活了从DCs成熟到T细胞扩增和浸润的完整抗肿瘤免疫链条。
结论与讨论
本研究成功构建了一种基于胶原酶渗透增强和低剂量化疗诱导免疫原性细胞死亡的协同纳米治疗平台（COL/DTX@BSA NPs）。该平台巧妙地解决了纳米药物在实体瘤中渗透不足的难题：BSA载体保护了COL的活性并将其递送至肿瘤部位，COL作为“分子剪刀”降解致密的ECM胶原屏障，为DTX的深度递送开辟了道路。抵达肿瘤深部的低剂量DTX不仅发挥化疗杀伤作用，更关键的是触发了ICD，释放肿瘤抗原和DAMPs，从而激活了强大的适应性免疫应答，实现了化疗与免疫治疗的协同增效。
这项研究的重要意义在于：第一，它提供了一种创新的“破壁-激活”双功能纳米药物设计思路，通过主动调节肿瘤微环境来克服药物递送障碍。第二，它验证了低剂量化疗药物诱导ICD并联合免疫治疗的可行性，有助于减少传统高剂量化疗带来的严重毒副作用。第三，该策略在4T1和B16F10两种不同的肿瘤模型中均显示出显著的抗肿瘤和抑制转移效果，并激发了全身性的抗肿瘤免疫记忆，具有潜在的广谱应用前景。这项工作为开发针对深部实体瘤的高效、低毒联合疗法提供了新的理论依据和实践参考，是纳米医学与肿瘤免疫治疗交叉领域的一项重要进展。
