基于结构的11β-羟基类固醇脱氢酶工程改造，实现辅因子再生并高效合成氢化可的松

《Molecular Catalysis》：Structure-guided engineering of 11β-hydroxysteroid dehydrogenase with cofactor regeneration for efficient hydrocortisone biosynthesis

理性设计与分子动力学模拟协同优化福寿螺来源的11β-羟类固醇脱氢酶（Fd11β-HSDH），通过alanine扫描和定点突变（L207R/Y221I）显著提升催化效率（kcat/Km值提高2.7倍）和热稳定性。结合葡萄糖脱氢酶介导的NADPH再生系统，构建的工程菌株在5升生物反应器中实现空间时间产量2.38 g·L?1·d?1，较野生型提高3.5倍。研究建立了基于微环境重构的酶工程新范式，为规模化甾体生物转化提供高效催化剂。

　　

朱强|朱帅北|姜振涛|李艳苗|朱超凯|张荣珍

江南大学生物技术学院，中国无锡214122

摘要

氢化可的松是一种临床上必不可少的糖皮质激素，但其生物催化生产受到天然11β-羟基类固醇脱氢酶（11β-HSDHs）的限制，这些酶活性较低、底物特异性狭窄且热稳定性差。本文从Fukomys damarensis中鉴定出一种新型11β-HSDH（FdHSDH），并通过合理改造实现了高效合成氢化可的松。野生型Fd11β-HSDH在NADPH存在下的最大活性为5.3 U，可生成25.3%的氢化可的松。通过丙氨酸扫描和位点饱和突变分析，确定L116、L207和Y221为关键残基。L207R/Y221I双突变体的比活性提高了1.7倍，催化效率（k_cat/K_m）也提高了2.7倍。分子动力学模拟（50 ns）显示，Y221I/L207R双突变通过协同作用重塑了底物口袋，使其体积从374.01 ?3减小到307.66 ?3，从而优化了底物与催化中心的结合；同时L207R还形成了有利的阳离子-π键和氢键网络。结合葡萄糖脱氢酶介导的NADPH再生系统，该工程化酶在整细胞中的氢化可的松转化率超过80%，时空产率为2.4 g·L?1·d?1。扩大至5 L规模后，产率仍保持在2.38 g·L?1·d?1，而野生型仅为0.67 g·L?1·d?1。这项工作提供了一种高性能的生物催化剂，并为类固醇生物转化提供了一种可推广的策略。

引言

氢化可的松（皮质醇）是一种由肾上腺皮质合成的关键内源性糖皮质激素，化学名称为11β,17α,21-三羟基孕-4-烯-3,20-二酮。作为一种药物，其强大的抗炎和免疫抑制作用使其在临床上不可或缺。此外，氢化可的松还是多种合成类固醇（如泼尼松龙、地塞米松和倍他米松）生物合成的关键前体[1]。氢化可的松的生理活性严重依赖于C11位置的β-羟基。这是其与前体皮质醇的唯一结构区别，皮质醇的C11位置具有非活性的羰基。从结构上看，氢化可的松仅在C11位置与皮质醇不同——皮质醇中的羰基在氢化可的松中被还原为羟基。尽管这一差异微妙，但氢化可的松具有更强的抗炎活性[2]。由于其优异的药理特性，对氢化可的松的临床需求持续增加，因此需要开发高效、高选择性和可持续的合成策略。

传统的氢化可的松化学合成通常涉及多个保护/去保护步骤，需要苛刻的反应条件，并且经常依赖昂贵的手性催化剂，导致可扩展性和环境可持续性较差[1],[3],[4],[5],[6]。使用Curvularia属或Absidia属等丝状真菌进行微生物发酵是一种生物替代方法，但通常受到低产率和较长培养时间的限制[7,8]。相比之下，使用纯化酶或工程化全细胞的生物催化方法在温和的水性条件下提供了更高的区域选择性和立体选择性。

氢化可的松合成的关键酶促步骤是C11位置的羰基还原反应，该反应由NADPH依赖的11β-羟基类固醇脱氢酶（11β-HSDHs）催化[6,9]。这些酶通过将活性形式（皮质醇）和非活性形式（氢化可的松）相互转化来调节糖皮质激素的活性。其中，来自Fukomys damarensis的11β-HSDH（Fd11β-HSDH）因其对还原反应的天然偏好而成为有前景的生物催化剂，符合工业生产需求。然而，像大多数天然酶一样，Fd11β-HSDH的催化效率较低、热稳定性有限，且在工艺条件下的底物耐受性有限，这些因素共同限制了其工业应用。天然的11β-羟基类固醇脱氢酶（11β-HSDHs），尤其是脊椎动物的11β-HSD1酶，由于其能够提供高区域选择性和立体选择性，在类固醇C11羰基还原方面具有天然优势；然而，天然酶的某些特性限制了它们作为可扩展生物催化剂的直接应用。首先，许多报道的11β-HSDHs/11β-HSD1s是微粒体或内质网相关的酶，其膜锚定拓扑结构和疏水表面区域导致在原核宿主中表达和聚集性能较差，需要通过截短或表面工程来获得可操作的、可溶的催化剂[10]。其次，它们的还原活性通常严格依赖于NADPH，在哺乳动物细胞中由H6PDH耦合系统维持的高NADPH/NADP?比例驱动；当转移到异源微生物平台时，辅因子的可用性和氧化还原平衡可能成为限速步骤，甚至可能影响反应方向[11]。第三，11β-HSD1的K_m值通常为微摩尔级，这意味着需要较高的底物负荷才能获得高的时空产率；然而类固醇底物在水介质中溶解性差，因此工艺开发通常依赖于共溶剂或替代反应介质，这可能对酶性能和下游处理产生负面影响[12]。这些限制促使人们开发蛋白质工程策略，以同时提高催化效率、可溶性表达/稳定性和辅因子偏好（例如，从NADPH转向NADH），以实现稳健的全细胞操作和经济可行的放大。

蛋白质工程已成为克服天然酶固有局限性的强大工具。基于结构和计算洞察的合理和半合理策略已成功提升了多种氧化还原酶的性能[13,14]。例如，Wang等人报告称，结构引导的突变提高了羰基还原酶的热稳定性和活性，从而提高了类固醇生物转化的产率[15]。类似地，Griffiths等人通过靶向底物通道残基提高了7β-HSDH的立体选择性[16]。然而，尽管这些研究强调了工程化类固醇转化酶的潜力，但关于11β-HSDH（特别是Fd11β-HSDH）的系统工程报告仍然较少。以往的努力往往集中在单一目标上，如提高稳定性或溶解性，而同时提高催化活性、热稳定性和底物亲和力通过微环境重塑则是非常理想的，但仍是一个巨大挑战[17,18]。这一挑战主要源于微环境工程的两个核心难题：（1）多个酶性能指标之间的内在权衡（例如，为提高稳定性而导致的刚性化可能会损害催化动力学）；（2）微环境因素（局部pH值、疏水性、分子拥挤）与酶构象之间的复杂非线性相互作用，目前缺乏可靠的预测模型。微小的扰动可能导致催化性能的不可预测波动，微环境异质性在级联系统中可能导致有毒中间体的积累和传质限制。这些复杂性突显了需要精确、基于机制的工程策略。

计算生物学的进步为这种精确的微环境工程提供了必要的工具。分子动力学（MD）模拟和自由能计算现在使研究人员能够超越静态快照，可视化控制催化和稳定性的残基相互作用网络和构象动态[19,20]。这些方法有助于识别对底物结合和过渡态稳定至关重要的残基，从而指导更少的实验迭代进行合理的酶设计。特别是，将活性位点重塑与灵活的环工程相结合，在提高多聚酶（包括酮类固醇异构酶和羰基还原酶）的特异性和热稳定性方面被证明是有效的[21]。

在这项工作中，我们报告了一项全面的半合理工程策略，旨在克服Fd11β-HSDH的活性-稳定性限制。通过整合同源建模、丙氨酸扫描和分子动力学模拟，我们确定了控制辅因子亲和力和底物取向的关键残基。在这些位点进行靶向突变后，获得了显著提高氢化可的松转化率的变体，从而为工业糖皮质激素生产提供了更高效的酶促途径。此外，将表现最佳的变体与高效辅因子再生系统结合在全细胞生物催化剂中应用，展示了卓越的性能和操作稳定性。这项研究不仅为工业糖皮质激素生产提供了一种稳健的生物催化剂，还概述了一种通过精确调节活性位点微环境来优化复杂类固醇转化酶的通用工程策略。这项工作展示了一种合理且可推广的策略，用于克服11β-HSDH的活性-稳定性权衡，并为类固醇转化生物催化剂的优化提供了新的见解。

化学品和试剂

使用大肠杆菌 BL21(DE3)作为宿主菌株，pET21a和pET28a质粒作为表达载体。细菌培养在添加了氨苄西林或卡那霉素的Luria–Bertani（LB）培养基中进行。异丙基-β-D-硫代半乳吡喃糖苷（IPTG）购自Sangon Biotech（上海，中国）。皮质醇和氢化可的松购自Sigma-Aldrich（上海，中国）。所有其他化学品均为分析级，无需进一步处理即可使用。

11β-HSDH候选酶的合理选择和文库构建

为了建立稳健的生物催化剂开发起点，我们采用了一种基于系统发育的合理策略（优于传统的随机筛选，因为它能够有针对性地选择具有预测功能相关性的进化多样化候选酶）[29]。我们获取了一组多样的羟基类固醇脱氢酶（HSDH）序列。

结论

在这项研究中，我们使用合理和半合理的设计策略，从Fukomys damarensis中工程化了一种高性能的11β-羟基类固醇脱氢酶（11β-HSDH）。确定了关键残基L207和Y221，L207R/Y221I突变体的k_cat/K_m提高了2.7倍，热稳定性也得到了增强。与BaGDH介导的NADPH再生系统结合后，在5 L生物反应器中的转化率超过80%，时空产率为2.38 g·L?1·d?1，野生型对比也证实了这一效果。

数据可用性声明

本研究中生成和/或分析的数据集可应相应作者的要求提供。

注释

作者声明没有竞争性财务利益。

伦理批准

本文不包含任何作者进行的涉及人类参与者或动物的研究。

CRediT作者贡献声明

朱强：撰写——原始草稿、可视化、验证、调查、正式分析、数据管理。朱帅北：可视化、验证、软件。姜振涛：可视化、验证、软件、正式分析。李艳苗：正式分析。朱超凯：数据管理。张荣珍：撰写——审稿与编辑、监督、项目管理、资金获取。

利益冲突声明

作者声明没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

本项目得到了国家重点研发计划（2023YFA0914500）、国家自然科学基金（32271487）、国家轻工技术与工程一流学科计划（LITE2018-12）以及学科人才引进计划（111-2-06）的支持。