《Molecular Phylogenetics and Evolution》：Phylogenomic species delimitation reveals distinct pace and mode of lineage evolution in
Amanita jacksonii
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基于63份标本的百余基因exon靶向测序，本研究确认Amanita jacksonii类群包含7个独立物种，揭示高海拔种群存在显著地理分化而低海拔种群分化较浅，分子钟显示该类群在约432万年前开始分化，多数物种形成于近200万年间，并证实Amanita jacksonii s.s.局限于阿帕拉契安地区及东部加拿大，凸显了多基因系统发育分析在解决形态相似真菌物种界定中的关键作用。
Santiago Sánchez-Ramírez|Rodham E. Tulloss|Simona Margaritescu|Daniel Pi?ero|Jean-Marc Moncalvo
多伦多大学生态与进化生物学系，加拿大安大略省多伦多市
摘要
Amanita jacksonii s.l. 是一个在蘑菇类真菌中界定物种时具有挑战性的案例，传统的形态特征和标准分子标记在明确的分类学区分上存在不足。通过对北美63个标本中超过100个基因位点进行外显子靶向测序，我们提供了强有力的系统基因组学证据，支持该密切相关的群体中存在七个不同的物种。我们的分析恢复了30,342个高质量变异体和平均长度为2.5 kb的172个位点，从而能够进行全面的遗传结构和物种界定分析。种群结构分析显示中美洲高地区域的种群具有明显的地理分布模式，但在美国低地森林物种中未发现明显的空间结构。多种基于共祖关系的物种界定方法一致支持了先前识别的分类单元，A. sp. jack5 和 A. sp. jack6 被合并为一个有结构的物种。分子年代测定表明该群体在更新世时期（约432万年前）开始分化，大多数物种形成事件发生在200万年的时间窗口内。值得注意的是，同域分布的低地物种显示出更深的遗传分化（6%–8%），而异地分布的高地物种分化程度较低（0.4%），这表明前者可能存在配子前障碍。我们的结果还证实 A. jacksonii s.s. 仅限于阿巴拉契亚地区和加拿大东部，这可能是冰川期后的扩张结果。这项研究展示了系统基因组学方法在解决形态相似的真菌分类单元的物种边界方面的能力，并为北美外生菌根真菌的多样化模式提供了见解。
引言
作为主要的真核生物谱系，真菌以其广泛的生态功能分类单元而闻名。然而，估计只有3%到8%的真菌物种被描述过（Hawksworth和Lücking，2017）。导致这种差异的主要因素包括由于许多真菌形式的隐秘性和短暂性（例如，微生物、内生菌或特化的短暂子实体）而产生的采样偏差，依赖分类学上信息不足的特征所带来的瓶颈，以及对许多关键栖息地（如土壤、海洋环境和热带森林）的探索不足（Blackwell，2011；Schoch等人，2012）。虽然PCR扩增和ITS序列测定在过去几十年中促进了真菌物种的发现（Hawksworth和Lücking，2017；Schoch等人，2012），并且为解决真菌生命树的努力提供了更多的遗传位点（例如LSU、SSU、rpb1、rpb2、tef1）以用于系统发育分析，但在某些分类单元中这些方法仍然不够充分（Gazis等人，2011；Kiss，2012；Sánchez-Ramírez等人，2015c）。物种复合体提出了独特的挑战，不仅因为物种识别和鉴定存在歧义（即由于隐秘性），还因为分类单元之间的分化较浅，导致标准标记的系统发育能力不足（Bickford等人，2007；Tekpinar和Kalmer，2019）。
在伞菌目（Agaricomycetes）中，Amanita属是一类多样且分布广泛的蘑菇形成物种，存在于世界大多数森林地区（Cui等人，2018）。这是因为大多数物种是外生菌根的，并与许多树种形成共生关系（Wolfe等人，2012）。系统上，该属被划分为几个在形态和分子上一致的部分，其中之一是Amanita sect. Caesareae Singer（Cui等人，2018；Endo等人，2017；Lupala等人，2025；Sánchez-Ramírez等人，2015b），包含大约70个已描述的分类单元。著名的蘑菇A. caesarea是Caesareae节的模式种，还包括其他因其传统用途而被世界各地许多民族认可的食用物种（Garibay-Orijel等人，2009；Pegler，2002；Sanmee等人，2003）。由于其高烹饪价值、经济价值和传统意义，凯撒蘑菇在全球许多地区都备受追捧（Pegler，2002；Sitta和Davoli，2012）。它们的流行性和高度形态相似性导致了一些名称（如A. caesarea和A. hemibapha）在不同大陆上的误用（Flores，2012；Pérez-Silva，1981；Tulloss，1986），最终导致了一个更广泛的形态物种复合体的描述（Guzmán和Ramírez-Guillén，2001）。
对该部分的分子系统发育分析表明，大多数具有明亮黄色、橙色和红色色素的物种属于一个地理分布广泛的支系。这些研究还表明，北美的一些分类单元起源于亚洲，至少有两个分类单元在过去的5百万年内经历了大陆性的分化过程（Sánchez-Ramírez等人，2015b；Sánchez-Ramírez等人，2015c；Sánchez-Ramírez等人，2015a）。其中一个事件产生了A. jacksonii Pomerl.（Pomerleau，1984）物种，通常被称为细长的美洲凯撒蘑菇。真菌学家和蘑菇爱好者已经绘制了从加拿大东南部到中美洲的A. jacksonii相似蘑菇的分布图。然而，通过对标本的形态鉴定和具有更广泛地理及种群水平采样的系统发育分析，至少识别出七个潜在物种（Sánchez-Ramírez等人，2015c），重新审视了仅限于北美分类单元内的物种复合体是否存在的问题。
为了更深入地了解A. jacksonii的生物学特性，研究人员发布了其基因组草图（Van Der Nest等人，2014），这可以作为进行更广泛的基因组水平物种界定和种群基因组学评估的起点（Hausdorf，2025）。鉴于真菌基因组的小尺寸、成本的显著下降以及新技术的出现，高通量测序有望通过更广泛的基因组探索为真菌系统学、分类学和物种界定提供新的视角（Xu，2020）。基于这一思路，我们分析了针对北美分布的与A. jacksonii密切相关的标本生成的超过一百个基因位点的数据集（Sánchez-Ramírez等人，2015c）。具体来说，我们的目标是更广泛地研究这些真菌的基因组，以（1）验证之前在A. jacksonii s.l.群体中识别的系统发育结构的一致性；（2）利用更可靠的数据揭示该群体的自然历史。
章节片段
真菌收集和DNA提取方法
本研究使用了63个标本，这些标本要么由作者从野外采集，要么从各种标本馆捐赠或借阅获得。大多数样本来自美国、加拿大和墨西哥的低地和高地温带及亚热带森林，包括墨西哥中部和南部的温带山脉（参见Sánchez-Ramírez等人，2015c）（图1B；补充文件S1）。DNA是从干燥的真菌组织（菌褶）中提取的，重量约为30–50毫克，使用改良的方法进行提取。
从外显子序列捕获中获得了数千个变异体和数百个基因位点
无论生物材料的来源如何（即干燥的标本馆收藏或PlantSaver卡片），外显子捕获方法都能成功获得高质量的数据以用于后续分析。同样，定制的NextFlow流程在多次重复实验中表现稳健且高效。平均而言，直接从NCBI SRA处理所有原始读取数据并生成用于后续分析的过滤后的VCF文件需要接近24小时。应用过滤器后，共获得了30,342个变异体。
系统基因组学增强了先前识别分类单元的支持
ITS区域的测序是识别和区分大多数真菌物种的标准方法。然而，我们之前的研究显示，从这个位点获得的变异信息不足以区分不同物种（Sánchez-Ramírez等人，2015b），这促使我们探索其他更具信息量的遗传位点（Sánchez-Ramírez等人，2015c）。在这里，我们在超过一百个基因位点的背景下重新评估了这些形态上高度相似的分类单元的物种级别地位。
CRediT作者贡献声明
Santiago Sánchez-Ramírez：撰写——原始草稿、可视化、软件开发、方法论设计、调查实施、形式分析、概念化。Rodham E. Tulloss：验证、数据管理。Simona Margaritescu：资源获取、方法论设计、数据管理。Daniel Pi?ero：监督、资源协调。Jean-Marc Moncalvo：撰写——审稿与编辑、监督、项目管理、资金申请。
资助
这项工作得到了墨西哥国家科学技术委员会（CONACYT）提供的全额博士学位奖学金，以及多伦多大学全球变化科学中心（CGCS）为< />J.M.M还获得了加拿大皇家安大略博物馆理事?和加拿大国家科学与工程研究委员会（NSERC）的资助。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
S.S.R感谢野外合作者（M. Torres-Gómez、N. Hernández-Rico、H. Hatzipetrakos）、标本馆管理员和真菌学家（L. Guzmán-Dávalos、J. Cifuentes-Blanco、R. Valenzuela、A. Estrada-Torres、F. Ruán-Soto、R. Petersen、B. Matheny、A. Wilson、R. Lebeuf、R. Archambault、G. Thorn）以及技术人员（F. Ramírez-Guillén、L. Pérez-Ramírez、V. Evenson、D. Torti）在材料收集、样本准备和信息提供方面的帮助。J.M.M.感谢R. Vilgalys（杜克大学）和M. Moncalvo。
