《Nano Today》：ZnO nanoparticle-educated exosomes inhibit osteosarcoma metastasis through HIF-1α/miR-1287–5p/Snail axis
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骨肉瘤（OS）是儿童青少年最常见的原发骨恶性肿瘤，尽管有新辅助化疗和手术进展，转移和复发仍是主要挑战。本研究发现ZnO纳米颗粒处理的OS细胞分泌的外泌体（ZnO-Exos）能显著抑制OS细胞增殖、迁移和侵袭。机制为Zn2+激活稳定HIF-1α，上调外泌体miR-1287-5p，后者抑制Snail基因表达，阻断上皮间质转化（EMT），从而抑制转移。动物模型证实ZnO-Exos有效抑制原发肿瘤和肺转移，且生物相容性好。该研究揭示了ZnO NP教育的外泌体通过Zn2+/HIF-1α/miR-1287-5p/Snail轴抑制转移的新策略。
何广平|黄正源|宗玉茹|海勇|张嘉宇|陈军|陈汉清
首都医科大学北京朝阳医院骨科，中国北京100020
摘要
骨肉瘤（OS）仍然是儿童和青少年中最常见的原发性骨恶性肿瘤。尽管新辅助化疗取得了进展，但转移和复发仍然是主要的临床挑战。氧化锌纳米颗粒（ZnO NPs）具有显著的抗癌活性，然而其在骨肉瘤中的抗转移机制仍不清楚。在这里，我们报道了一种基于生物启发的策略，使用从ZnO NP处理的骨肉瘤细胞（ZnO-Exos）中提取的外泌体，这些外泌体显著抑制了骨肉瘤细胞的存活能力、迁移和侵袭性。从机制上讲，ZnO-Exos释放的Zn2+离子激活并稳定了缺氧诱导因子-1α（HIF-1α），后者通过转录上调了外泌体miR-1287–5p的表达，进而直接靶向并下调了Snail的mRNA，Snail是一种驱动上皮-间质转化（EMT）的主要转录抑制剂。在原位骨肉瘤小鼠模型中，肿瘤内注射ZnO-Exos显著抑制了原发肿瘤的生长和自发肺转移，延长了生存期，并表现出优异的生物相容性。总体而言，这项研究揭示了一种新的ZnO NP教育的外泌体，它们通过Zn2+/HIF-1α/miR-1287–5p/Snail轴发挥抗转移作用，为骨肉瘤的治疗和转移抑制提供了一种靶向且低毒性的策略。
引言
骨肉瘤（OS）是儿童和青少年中最常见的原发性恶性肿瘤，由于其侵袭性行为和高肺转移倾向，它代表了巨大的临床挑战[1]，[2]。尽管多模式治疗（主要是新辅助化疗和根治性手术的组合）取得了显著进展，但与化疗耐药性、肿瘤转移和复发相关的挑战仍然需要解决[3]，[4]。骨肉瘤的转移过程虽然起源于间质组织，但其特征与癌瘤有共同之处，特别是激活了类似于上皮-间质转化（EMT）的程序。EMT使肿瘤细胞具有更强的迁移能力、侵袭性和抗凋亡性，从而促进它们从原发部位逃逸并定植于远端器官[5]，[6]，[7]。因此，揭示EMT的分子驱动因素并开发破坏这一程序的策略对于改善骨肉瘤的预后至关重要。
在寻找新的治疗途径方面，纳米技术已成为肿瘤学中的一个变革性前沿[8]，[9]，[10]，[11]，[12]，[13]。在各种纳米材料中，氧化锌纳米颗粒（ZnO NPs）因其优异的生物相容性、对癌细胞的选择性细胞毒性以及被美国食品药品监督管理局（FDA）认定为“一般公认安全”（GRAS）而受到广泛关注[14]，[15]。然而，关于ZnO NPs对肿瘤转移的治疗效果和机制的深入研究仍然很少，尤其是在骨肉瘤中。我们之前的研究表明，ZnO NPs通过释放Zn2+离子并稳定和上调缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）来选择性地抑制骨肉瘤细胞的增殖和迁移[16]。HIF-1α是细胞对缺氧适应性反应的主要转录调节因子，这是实体瘤微环境的普遍特征。除了在糖酵解和血管生成中的作用外，HIF-1α还是转移的强大促进因子，影响细胞的运动性、侵袭性和EMT[17]，[18]。然而，ZnO NP诱导的HIF-1α在骨肉瘤中发挥抗转移作用的具体下游效应器仍很大程度上尚未明确。
随着对microRNAs（miRNAs）作为基因表达关键转录后调节因子的理解不断加深，它们在癌症生物学中的关键作用得到了广泛认可[19]，[20]。有趣的是，许多miRNA基因在其启动子区域含有缺氧反应元件（HREs），使它们成为HIF-1α的直接转录靶标[21]，[22]。然而，从大量的细胞内miRNAs中识别出哪些特定的HIF-1α调控miRNAs负责介导抗转移效应仍然是一个艰巨的挑战。外泌体是一种天然分泌的纳米囊泡（30–150 nm），来源于内吞作用，最近在细胞间通讯研究中成为焦点[23]，[24]。重要的是，肿瘤来源的外泌体可以将致癌信息（包括miRNAs）水平传递给邻近或远端的细胞，重新编程肿瘤微环境和转移前微环境以促进转移[25]，[26]。相反，这一特性也可以用于治疗目的。外泌体具有低免疫原性、高生物相容性、在循环中的稳定性以及穿越生物屏障的天然能力，使其成为药物递送和疾病特异性生物标志物的理想候选者[27]，[28]。同时，外泌体的分子谱型，特别是其miRNA含量，提供了细胞内调控网络的集中和相关快照，可能比全细胞分析更简化了关键功能miRNAs的识别[22]，[29]。
在这项研究中，我们验证了一种基于生物启发的策略，使用由骨肉瘤细胞分泌的ZnO NP教育的外泌体（称为ZnO-Exos）。这些经过修饰的ZnO-Exos在被受体骨肉瘤细胞内化后，传递一种治疗性分子负载，通过改变细胞内的离子和缺氧信号环境来破坏转移程序。通过基因测序、分子生物学和功能分析，我们确定外泌体miR-1287–5p是一个关键的中介因子。我们进一步描绘了一个完整的信号轴，其中ZnO-Exos释放的Zn2+激活HIF-1α，后者转录诱导miR-1287–5p。这种miRNA反过来直接靶向并抑制Snail的mRNA，Snail是E-钙粘蛋白的关键转录抑制剂和EMT的主要调节因子。通过抑制Snail，ZnO-Exos传递的miR-1287–5p恢复了上皮特性并阻断了骨肉瘤细胞的迁移和侵袭。最后，在一个临床前骨肉瘤模型中，我们证明了ZnO-Exos在抑制原位肿瘤生长和自发肺转移方面的强大效果，并具有优异的安全性。基于以上所有结果，我们证明ZnO NP教育的外泌体有效地逆转了EMT程序，恢复了上皮标记物，并通过Zn2+/HIF-1α/miR-1287–5p/Snail信号轴降低了骨肉瘤的转移潜力（图1）。
部分摘录
ZnO NPs教育过的骨肉瘤细胞来源的外泌体（ZnO-Exos）的分离和表征
为了生成NP教育过的细胞外泌体，人类骨肉瘤细胞系U2OS和143B暴露于亚细胞毒性浓度的ZnO NPs[30]，分别称为UZnO-Exos和BZnO-Exos。透射电子显微镜（TEM）观察到Ctrl-Exos和ZnO-Exos表现出典型的碟形形态，尺寸范围为50–150 nm（图1A），并通过动态光散射（DLS）检测到这两种类型外泌体的粒径分布（图S1）。脂质双层的完整性得到了保持，
讨论
这项研究阐明了一种新的纳米-生物界面，其中ZnO NPs重新编程了肿瘤细胞的分泌特性，生成了具有强抗肿瘤活性的外泌体，这些外泌体通过一个连贯的Zn2+/HIF-1α/miR-1287–5p/Snail轴抑制骨肉瘤的生长和转移。
结论
总之，我们证明了从ZnO NP处理的骨肉瘤细胞中提取的外泌体是肿瘤转移的强大抑制剂。该机制涉及一个顺序激活的信号轴：内吞的ZnO-Exos释放Zn2+来稳定HIF-1α，然后外泌体miR-1287–5p由HIF-1α上调，并且由ZnO-Exos衍生的miR-1287–5p被传递到受体细胞，在那里它直接抑制Snail，从而抑制EMT和转移进程。
细胞培养
人类骨肉瘤（OS）细胞系U2OS和143B以及正常小鼠前成骨细胞系MC3T3-E1来自美国典型培养收集中心（ATCC）。U2OS和143B细胞在Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）中培养，而MC3T3-E1细胞在α-改良的Eagle培养基中培养。所有培养基都添加了10%的胎牛血清（FBS）、100 IU/mL的青霉素和100 μg/mL的链霉素。细胞在37°C下、5% CO?的湿润环境中培养
CRediT作者贡献声明
张嘉宇：方法学、研究、正式分析。
陈军：项目管理、资金获取。
宗玉茹：验证、研究、数据管理。
海勇：写作——审阅与编辑、监督。
何广平：写作——初稿、可视化、监督、方法学、研究、资金获取、正式分析、数据管理。
黄正源：验证、研究、数据管理。
陈汉清：写作——审阅与编辑、监督、项目
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文报告的工作。
致谢
这项工作得到了国家自然科学基金（编号32171370和82203893）和北京市自然科学基金（编号L248075和258064）的支持。
