《NanoImpact》：Effects of true to life polyethylene terephthalate and polycaprolactone nanoparticles on macrophages under a repeated exposure mode
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本刊推荐：面对日益严重的环境微纳米塑料污染，传统急性暴露实验难以模拟实际长期、低剂量接触场景。本研究创新性地采用重复暴露模式，对比研究了不可生物降解的真实环境来源聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）纳米颗粒与可生物降解的聚己内酯（PCL）纳米颗粒对巨噬细胞的长期影响。研究发现，尽管细胞通过蛋白质组适应性变化减弱了整体扰动，但PET仍诱导氧化应激和促炎反应，而PCL则抑制了巨噬细胞应对细菌挑战的细胞因子产生能力，揭示了长期接触下两类纳米塑料均存在有害效应，强调了对可降解塑料安全性进行长期评估的必要性。
塑料，这种凭借其优异性能和便利性而风靡全球的材料，正悄然演变成一场席卷整个星球的污染危机。每年，数以百万吨计的塑料废弃物通过不当处理进入环境，从海洋到淡水，从土壤到空气，甚至在偏远的南极，科学家们都已检测到其踪迹。这些塑料在环境中难以降解，其半衰期可达数十年，导致持续的积累。更令人担忧的是，这些大块塑料会经过紫外线光氧化、风力磨损、波浪作用等过程，逐渐破碎成微塑料（尺寸小于1毫米），进而变成纳米塑料（尺寸小于1微米）。这些极其微小的颗粒能够更轻易地穿越生物屏障，进入生物体内。
一旦进入生物体，作为免疫系统“清道夫”的巨噬细胞（macrophages）便首当其冲，负责识别和吞噬这些外来颗粒。因此，巨噬细胞成为研究塑料颗粒生物效应的关键细胞类型。然而，目前绝大多数毒理学研究采用的实验方案是“急性暴露”模式：即细胞一次性接触较高剂量的塑料颗粒，并在接触后立即检测各项指标。这种模式虽然经典，却忽略了现实中生物体长期、低剂量、反复接触塑料污染的真实情况，既未考虑塑料颗粒在体内的生物持久性（biopersistence），也未考虑细胞在反复刺激下可能发生的适应性变化。
那么，在更贴近真实世界的“重复暴露”模式下，巨噬细胞会如何应对不同类型的纳米塑料？特别是，被寄予厚望、旨在解决污染累积问题的可生物降解塑料，其纳米颗粒在长期接触下是否就绝对安全？为了回答这些问题，来自法国格勒诺布尔阿尔卑斯大学等机构的研究团队Véronique Collin-Faure、Aliro Villacorta、Hélène Diemer、Sarah Cianférani、Ricard Marcos、Alba Hernandez、Marie Carrière、Elisabeth Darrouzet和Thierry Rabilloud进行了一项深入研究，他们选择了两种代表性材料：一种是在环境中持久存在、源自真实矿泉水瓶的聚对苯二甲酸乙二醇酯（polyethylene terephthalate, PET）纳米颗粒；另一种是具有良好生物降解性的聚己内酯（polycaprolactone, PCL）纳米颗粒。他们采用重复暴露方案（连续8天，每天给予低剂量），并结合蛋白质组学（proteomics）和靶向实验，系统评估了巨噬细胞在长期接触下的反应。这项重要的研究成果发表在《NanoImpact》期刊上。
为开展此项研究，作者主要运用了几项关键技术方法：首先，使用透射电子显微镜（TEM）和动态光散射（DLS）对PET和PCL纳米颗粒的形貌、尺寸及表面电位进行表征。其次，采用小鼠巨噬细胞系J774A.1作为细胞模型，在低血清条件下培养以模拟缓慢增殖状态，并实施为期8天的重复暴露方案（每日10 μg/mL）。核心的分析手段是无标记定量鸟枪法蛋白质组学（shotgun proteomics），结合纳米液相色谱-串联质谱（nanoLC-MS/MS）技术，全面分析细胞蛋白质组的改变。此外，还运用了一系列靶向功能实验，包括使用流式细胞术（flow cytometry）检测线粒体膜电位（使用Rhodamine 123）、细胞氧化应激水平（使用DHR123）、溶酶体活性（使用Lysosensor）、吞噬功能（使用荧光乳胶微球），以及细胞表面标志物（如CD86、TLR2等）和促炎细胞因子（如IL-6、TNF-α、MCP-1）的释放。
研究结果
3.1. 颗粒表征与内化
研究使用的纳米颗粒与先前急性暴露实验为同一批次。透射电镜图像显示，PET颗粒形状不规则且非球形，而PCL颗粒为球形。在重复暴露模式下，PET颗粒的内化率接近定量（99% ± 3%），显著高于急性暴露时的66%。PCL颗粒的内化率为62% ± 5%，同样高于急性暴露时的38%，作者认为部分原因可能是PCL在巨噬细胞内发生了降解，导致标记染料释放，从而低估了实际积累量。
3.2. 蛋白质组学结果的全局分析
蛋白质组学共检测并定量了3328种蛋白质。主坐标分析显示，重复暴露后，对照组、PET组和PCL组的样本点相互交织，表明蛋白质组变化非常温和。相比之下，使用相同累积剂量进行急性暴露的数据则显示出明显的组间分离。相似性分析（ANOSIM）也证实，重复暴露引起的蛋白质组水平变化在统计学上不显著，接近组内变异水平，这与急性暴露的显著差异形成鲜明对比。这表明在重复暴露模式下，细胞对纳米塑料产生了逐步适应。
尽管如此，通过曼-惠特尼U检验（p < 0.05）仍能筛选出响应颗粒处理的特定蛋白质。其中，254种蛋白质响应PET处理，282种响应PCL处理。通路分析（使用DAVID工具）指出，受调变的细胞过程包括线粒体、溶酶体、内质网等。
3.3. PCL或PET颗粒未诱导线粒体膜电位改变
尽管许多线粒体蛋白丰度发生改变，但功能检测显示，重复暴露于PET或PCL颗粒均未引起线粒体跨膜电位（mitochondrial transmembrane potential）的显著扰动，表明在蛋白质组水平观察到的变化是稳态性的。
3.4. PET颗粒诱导氧化应激，而PCL颗粒未诱导
通过二氢罗丹明123（DHR123）氧化检测细胞氧化应激水平。结果显示，重复暴露于PCL颗粒未引起氧化应激的显著变化。然而，暴露于PET颗粒则观察到了氧化应激水平的显著升高。
3.5. PCL颗粒诱导溶酶体增多，而PET颗粒未显著诱导
蛋白质组学筛选出26种溶酶体蛋白丰度在重复暴露后发生改变。功能检测（Lysosensor法）表明，暴露于PET颗粒仅引起溶酶体活性不显著的增加，而暴露于PCL颗粒则导致了溶酶体活性的显著升高。对于PCL颗粒，溶酶体活性的增强可能促进了其生物降解速率。
3.6. PET颗粒轻微抑制吞噬作用，而PCL颗粒无影响
检测巨噬细胞吞噬荧光乳胶微球的能力。结果显示，重复暴露于PET纳米颗粒会轻微但显著地抑制吞噬功能，而PCL纳米颗粒对此功能没有显著影响。
3.7. 表面标志物在重复暴露于PET和PCL颗粒后发生改变
虽然通路分析未突出免疫反应通路，但详细分析及靶向流式细胞术检测发现，多种细胞表面标志物发生显著变化。例如，PET颗粒暴露显著降低了活化标志物CD86的表达；清道夫受体CD204（MSR-1）在两种颗粒暴露后均显著下降；而病原体识别受体TLR2在两种颗粒暴露后均显著增加；TLR7则在PCL暴露后显著下降。这些变化可能影响巨噬细胞的免疫识别和清除功能。
3.8. PET颗粒诱导促炎细胞因子释放增加，而PCL颗粒诱导其减少
检测促炎细胞因子白细胞介素6（IL-6）、单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）和肿瘤坏死因子α（TNF-α）的分泌。结果显示，仅暴露于PET颗粒会自发增加这些细胞因子的分泌，显示出固有的促炎效应。相反，仅暴露于PCL颗粒则会减少其分泌，显示出固有的抗炎效应。当用细菌脂多糖（LPS）挑战细胞时，PET和PCL都降低了LPS诱导的IL-6释放，PCL还降低了TNF-α的释放。这表明，暴露于PCL纳米颗粒的巨噬细胞对细菌挑战的应答能力被削弱。
结论与讨论
本研究清晰地表明，重复暴露模式引发的巨噬细胞反应与急性暴露模式下的反应存在显著差异。在整体生理层面，重复暴露引起的蛋白质组扰动更温和，提示细胞发生了适应性调整。然而，这种适应并未消除有害效应，反而揭示了在长期接触背景下更具现实意义的毒理学终点。
对于不可生物降解的PET纳米颗粒，尽管细胞整体适应良好，但其在细胞内的持久存在导致了持续的氧化应激和自发的促炎反应。同时，其轻微抑制吞噬功能和下调某些表面受体（如CD204）的趋势，可能损害巨噬细胞的“清道夫”功能和免疫监视能力。
对于可生物降解的PCL纳米颗粒，情况则更为复杂且值得警惕。虽然其未引发氧化应激，且细胞通过增强溶酶体活性来应对降解需求，但其降解产物6-羟基己酸（6-hydroxyhexanoic acid）已知具有抗炎作用。这解释了实验中观察到的PCL暴露抑制巨噬细胞基础及LPS刺激下促炎细胞因子产生的现象。这种“免疫抑制”效应意味着，长期接触PCL纳米颗粒的巨噬细胞在面对细菌感染时，其启动有效免疫防御的能力可能被削弱。同时，PCL暴露也改变了TLR2和TLR7等关键模式识别受体的表达，并下调了CD204，这进一步可能影响其病原体识别和清除功能。
因此，研究的核心结论是：在更贴近真实暴露场景的重复接触模式下，无论是持久性的PET还是可生物降解的PCL纳米塑料，均对巨噬细胞功能产生了显著且性质不同的有害影响。PET倾向于驱动促炎和氧化损伤路径，而PCL则可能导致免疫抑制，削弱宿主防御。这强烈提示，可生物降解性（biodegradability）本身并不能等同于生物安全性（biosafety）。在塑料制品的整个生命周期中，无论是在使用期内释放的颗粒，还是在完全降解前因废弃物处理不当而进入环境的颗粒，都可能带来潜在的健康风险。
这项工作与近期其他关于塑料颗粒长期暴露影响的研究（如在肺上皮细胞中观察到PET诱导上皮-间质转化和致癌特征，或聚苯乙烯（PS）颗粒在长期暴露下显示出促癌潜能）一起，共同强调了超越传统急性暴露毒理学研究范式的紧迫性。对于微纳米塑料这类具有生物持久性或涉及降解产物释放的污染物，长期、低剂量的重复暴露研究对于全面、准确地评估其健康风险至关重要，是未来环境健康领域不可或缺的研究方向。
