《Optics and Lasers in Engineering》：Wavelength-encoded reflection matrix for nano-scale quantitative phase tomography with breaking-through diffraction-limit resolution
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定量相位断层成像技术RM-QPT实现了8纳米轴向分辨率和22%突破衍射极限的横向分辨率，成像速度达1秒/帧，可无标记检测脑脊液缺失和肠组织精细结构，对比传统荧光及相位显微镜更具优势。
Jing Cao|Yating Yu|Yulong Dai|Zongshuo Hao|Ling Fu|Qian Liu
中国海南省海南大学生物医学工程学院生物医学工程重点实验室，三亚572025
摘要
定量相位显微镜（QPM）由于其较低的光毒性和无光漂白现象，已成为细胞和组织研究的宝贵工具。基于干涉的相位显微镜通常依赖于建立光程差（OPD）与相位之间的关系来实现无标记的三维（3D）成像。然而，这种3D成像仅能显示样本的表面形态，无法提供深度信息。波长编码反射矩阵定量相位断层扫描（RM-QPT）的发展使得实现8纳米超高轴向分辨率的断层成像成为可能。最初，通过标准分辨率目标测试实验验证了RM-QPT的横向分辨率，结果显示其将衍射极限提高了22%。此外，该系统能够以1秒的速度对300 × 300 × 5 μm3的体积进行成像。随后，通过RM-QPT对小鼠脑室和伏隔核的切片进行了定量分析验证。与传统商用相位显微镜相比，我们的系统能够检测到脑脊液的缺失。最后，对离体猪肠组织的成像结果进行比较后发现，基于OPD的结构成像比基于荧光的技术提供了更详细的图像和更高的清晰度。这项工作为新型计算相位断层扫描技术铺平了道路，该技术具有纳米级轴向分辨率、突破衍射极限的横向分辨率以及高速成像特性，适用于无标记的生物医学研究和内窥镜应用。
引言
如今，高分辨率、高对比度和高灵敏度的光学显微镜被广泛认为是许多应用中不可或缺的工具，包括基础研究、临床实践和工业测量。基于荧光的显微镜作为一个非常重要的分支，依赖于使用标记剂或化学探针来靶向特定的细胞成分或分子。自20世纪以来，已经开发出了多种著名的光学荧光显微镜方法，包括共聚焦[1,2]、多光子[3,4]和光片[5,6]显微镜。这些方法能够提供微观或细胞级别的分辨率，用于观察生物样本。为了更详细地观察细胞内部，采用了分子级探针和单分子定位方法，从而产生了现在被称为超分辨率显微镜的技术[[7], [8], [9]]。典型方法包括受激发射耗尽显微镜[10,11]、光激活定位显微镜[12,13]、随机光学重建显微镜[[14], [15], [16]]和结构化照明显微镜[17,18]。这些方法提供了亚波长或纳米级的分辨率，从而绕过了传统显微镜的衍射极限。这一特性使它们特别适用于遗传学和制药研究领域。然而，应当注意的是，上述荧光成像技术不适用于未标记的组织或细胞成分。此外，化学标记带来的光毒性是其应用的一个限制因素。在涉及荧光标记的内窥镜成像的临床应用中，患者在使用荧光物质后可能出现过敏反应和其他并发症，这可能会引发争议。
为了解决上述问题，相位显微镜利用折射率、双折射和OPD等自然属性作为无标记生物组织成像的对比度[19]。定性相位显微镜，也称为相位可视化成像，能够在细胞水平上进行无标记测量。典型技术包括相位对比成像（PCI）[20,21]和差分干涉对比（DIC）[22,23]。PCI依赖于样品各向异性内部结构引起的折射率变化来衍射入射光并产生相位移动，最终在成像结果中形成对比度。对于DIC显微镜，在来自同一光源的两束正交偏振光之间引入横向剪切。经过样品后，干涉信号与剪切方向上的相位梯度相关。然而，对于PCI和DIC显微镜，图像强度与实际相位之间的关系是非线性的。因此，这两种方法不能用于定量分析。为了准确描述样品特征尺寸，提出了另一种定量相位显微镜（QPM），包括波前传感[24,25]、数字全息[26,27]、相位恢复方法[28,29]、光学干涉测量[30,31]和傅里叶光栅[32,33]。其中，波前传感受到镜头物理尺寸的限制，并且没有充分利用相机的所有像素，从而导致分辨率较低，这也是非干涉方法的缺点。在数字全息领域使用高相干光源也会对其成像分辨率造成限制，这种限制被称为相干衍射极限，它将分辨率限制在非相干配置下可实现分辨率的大约一半。此外，由于依赖于额外的参考光束，测量相位对外部环境敏感。相位恢复方法通常需要多次迭代强度图像，以确保获得最佳质量的结果。显然，成像速度明显慢于实时速度，因此不适合用于临床疾病筛查。除了相位显微镜之外，还有许多研究致力于相位断层扫描技术的发展[[34], [35], [36]]。
为了解决上述问题，并借鉴反射矩阵成像方法在克服散射方面的优势，我们提出了一种新型RM-QPT，具有以下三个优点：（1）共路径配置和波长编码子矩阵策略，实现8纳米的超高轴向分辨率；（2）正则化校准和香农熵校正，将横向分辨率提高22%；（3）300 × 300 × 5 μm3体积的高成像速度为1帧/秒。使用标准USAF分辨率目标对这些关键成像性能进行了评估。随后，该技术被应用于小鼠脑片的成像，我们的成像结果与商用相位显微镜的结果进行了比较。本研究采用相位差作为生成对比度的手段，从而有效识别了脑室内脑脊液的缺失。相比之下，依赖折射率原理生成对比度的商用相位显微镜无法区分这种缺失。此外，通过引入波长编码反射矩阵成像技术，QPM进一步发展为QPT，实现了纳米级断层成像，提供了更全面的样本内部结构信息。
除了显微镜领域外，基于OPD的相位成像理论框架还应用于无标记内窥镜领域，这取决于兼容光纤和微型透镜的部署。众所周知，在内窥镜中使用荧光染料常常与不良反应（包括过敏）相关。相比之下，无标记相位内窥镜不受这些问题的影响。因此，使用RM-QPT和商用共聚焦内窥镜对离体猪肠组织的成像结果进行了比较分析。研究结果表明，基于相位的成像技术提供了比荧光标记技术更精确和更清晰的结构信息。这一发现为从显微镜到内窥镜的应用铺平了道路。
章节片段
从传统的定量相位显微镜到纳米级定量相位断层扫描
如现有文献所示，相位显微镜技术利用OPD作为成像对比度[37,38]。准确测量OPD并建立OPD与相位差（δ）之间的对应关系尤为重要。如图1(a)所示，采用共路径干涉策略确保光线进入样品前的光路相同。
讨论
总结来说，提出了一种新型定量相位成像方法RM-QPT，用于无标记样本的三维成像。该方法具有以下三个特点：（1）通过波长编码子矩阵策略实现纳米级轴向分辨率或光学切片断层扫描；（2）通过基于熵的正则化校准反射矩阵，实现突破衍射极限的横向分辨率；（3）成像速度为1帧/秒，适用于300 × 300 × 5 μm3的体积。
第1节――突破衍射极限横向分辨率的反射矩阵校准
整个校准过程包括三个主要阶段：反射矩阵的分解、基于熵的正则化校准和波长编码子矩阵重建。
首先，对反射矩阵（R）进行奇异值分解，如方程（1）所示。其中U和V分别表示分解过程中得到的空间向量集。矩阵∑是一个对角矩阵，其对角线上仅包含非零元素。
代表所有作者
本文中的任何材料均未在其他地方发表或正在考虑发表。
作者声明没有利益冲突。
所有涉及动物的实验均获得了海南大学动物护理和使用委员会的批准。
评估论文结论所需的所有数据均包含在正文中和补充材料中。可通过合理请求从作者处获得与本文相关的额外数据。
资助
国家自然科学基金（62205093）；海南省科技创新人才基金（KJRC2023B06, KJRC2025B11）；海南省科技专项基金（ZDYF2023SHFZ135）。
CRediT作者贡献声明
Jing Cao：概念设计、项目管理、初稿撰写、审稿与编辑。Yating Yu：形式分析、方法学。Yulong Dai：软件开发。Zongshuo Hao：实验研究。Ling Fu：监督、审稿与编辑。Qian Liu：监督、审稿与编辑。
