《Osteoarthritis and Cartilage》：The activity “blind spot”: why understanding which proteinases are active, not merely present, is essential for rigorous osteoarthritis research
编辑推荐：
蛋白酶活性在骨关节炎中的研究盲点及检测方法进展。通过综述生化及蛋白质组学证据，指出传统方法高估蛋白酶活性，强调需区分蛋白酶不同形式（如酶原、复合体、失活体），并评估现有检测技术（荧光底物、降解组学、活性探针）的适用性，为建立基于活性的生物标志物和治疗靶点提供理论依据。
大卫·J·威尔金森（David J. Wilkinson）| 苏尼尔·S·阿普特（Suneel S. Apte）| 山本和宏（Kazuhiro Yamamoto）
利物浦大学生命历程与医学科学研究所肌肉骨骼生物学与衰老科学系，威廉·亨利·邓肯大楼（William Henry Duncan Building），西德比街6号（6 West Derby St），利物浦L7 8TX，英国
摘要
目的
蛋白酶是骨关节炎（OA）中关节软骨分解的关键驱动因素。大多数研究通过测量RNA或蛋白质的丰度来推断蛋白酶的参与情况，尽管蛋白酶除了其活性形式外，还可以存在于多种非活性状态中。本文探讨了OA研究中的一个关键“盲点”，即人们常常认为蛋白酶的存在等同于蛋白水解活性。我们强调，了解哪些蛋白酶处于活性状态、在何时何地处于活性状态，对于深入理解其作用机制和推动转化医学研究至关重要。
研究设计
本综述综合了关于软骨和滑液生化、功能及蛋白质组学研究的证据，以探讨OA中蛋白酶活性的调控机制。我们总结了那些会影响基于丰度测量结果解释的蛋白酶分子状态，并对用于评估历史和当前蛋白水解活性的现有及新兴方法进行了批判性评估。这些方法包括新表位抗体、降解组学（degradomics）、荧光肽底物、酶谱分析（zymography）和基于活性的探针，重点介绍了它们的优势、局限性和应用领域。
结果
越来越多的证据表明，在OA中，蛋白酶的丰度与其蛋白水解活性之间存在脱节。蛋白酶的激活、内源性抑制剂的抑制作用、内吞作用以及蛋白水解失活都会影响最终的蛋白水解活性，但这些过程在传统的转录组学、抗体检测或蛋白质组学方法中大多难以被检测到。以活性为导向的研究揭示了OA关节中比以往认为的更为广泛且异质性的蛋白水解现象。
结论
OA中的关节破坏不仅受蛋白酶表达的影响，还受到其严格调控的空间和时间激活机制的制约。因此，基于丰度的测量方法可能会高估实际的蛋白水解程度。更加重视直接或间接的活性测量方法（可以将其称为“蛋白酶活性组”protease “activome”）将有助于提升实验结果的准确性，改善疾病的分层研究，并促进基于活性的生物标志物和治疗策略的发现。
部分摘录
概述
大量研究通过将骨关节炎（OA）患者与非OA对照组或疾病不同阶段进行比较，来探讨分解代谢蛋白酶的变化。然而，使用mRNA水平进行的研究存在一个局限性，即转录并不一定等同于蛋白质的合成。在本文中，我们认为即使通过传统方法测量蛋白酶的蛋白质水平也可能产生误导。我们建议更好地了解蛋白酶可能存在的多种形式。
蛋白酶在软骨破坏中的作用
在OA中，蛋白酶不仅是软骨破坏的关键驱动因素，还参与炎症反应和骨重塑过程。软骨中的细胞密度相对较低，但含有丰富的细胞外基质（ECM），主要包括II型胶原和蛋白聚糖aggrecan，这些成分以与透明质酸相连的大分子聚集体形式存在。其他多种蛋白聚糖、含量较少的胶原及其他ECM成分也在组织中发挥重要作用。
蛋白酶活性≠蛋白酶的丰度
蛋白酶除了活性形式外，还可以存在于多种非活性状态（见图1）。典型的基于蛋白质组学的方法（如shotgun LC-MS/MS、O-link、SomaScan）往往无法区分这些状态。此外，除了少数能识别活性蛋白酶的抗体外，绝大多数传统抗体及相关方法（如Western blotting、免疫组化（IHC）、酶联免疫吸附测定（ELISA）等）也无法准确区分这些状态。
研究OA中蛋白酶活性的方法
下文介绍了常用的蛋白酶活性检测方法。我们区分了用于检测历史活性（通过残留片段识别过去的底物切割事件）的方法和用于检测当前蛋白水解活性的方法（见图2）。有些方法应用广泛且易于获取，而另一些方法则处于发展阶段或具有较高的技术要求。每种方法都有其优势和局限性（见表1），选择“最佳”方法完全取决于具体研究需求。
讨论与未来展望
测量总蛋白酶水平是否一定意味着活性增加？正如本文所讨论的，未必如此。正如目前普遍认可的观点，mRNA水平的变化并不总是对应于蛋白质水平的变化一样，我们应该引导研究领域更加细致地理解：通过常规抗体检测或蛋白质组学方法获得的蛋白酶水平并不能直接证明蛋白水解活性的差异。
作者贡献声明
大卫·J·威尔金森（DJW）、苏尼尔·S·阿普特（SA）和山本和宏（KY）共同参与了概念的提出、初稿的撰写以及后续的审阅和编辑工作。
致谢
大卫·J·威尔金森（DJW）和山本和宏（KY）分别获得了英国关节炎协会（Arthritis UK）的资助（资助编号分别为22418和23137）。大卫·J·威尔金森（DJW）还获得了英国生物技术研究与创新委员会（BBSRC）的资助（资助编号UKRI1899）。山本和宏（KY）获得了日本学术振兴会（JSPS）的研究启动资助（资助编号JP25K23708）。苏尼尔·S·阿普特（SA）获得了美国国立卫生研究院（NIH）的资助（资助编号AR085047）。图1（协议编号WM29BM0FU9）和图2（协议编号CO29BM0W7D）使用BioRender软件制作（Wilkinson, D. (2026) https://BioRender.com/zee47d3, Wilkinson, D. (2026) https://BioRender.com/kcxlne1）。
