由组织蛋白酶L基因介导的杀虫剂联苯唑亚致死胁迫耐受性 在红蜘蛛（Tetranychus urticae）中的TuCTS-L2基因

《Pesticide Biochemistry and Physiology》：Tolerance to sublethal stress of pesticides bifenazate mediated by cathepsin L genes TuCTS-L2 in spider mite Tetranychus urticae

本研究确定涕虫威对两种斑蛛螨的亚致死浓度为LC10=0.481 mg/L和LC30=2.292 mg/L，通过转录组测序发现5个cathepsin L基因，其中TuCTS-L2表达显著上调，RNA干扰实验证实其与存活率和抗性相关，为抗性机制研究提供依据。

　　

王月|聂鹏程|魏斌|刘学春|余鹏亮|肖俊和|陈尧年|尚素琴|尤瑟夫·德维尔

甘肃省农业大学植物保护学院，作物病虫害生物防治工程实验室，兰州730070，中国

摘要

二斑叶螨（Tetranychus urticae）是一种全球性重要的农业害螨，其防治面临亚致死浓度诱导的对杀螨剂耐受性的挑战。为了阐明二斑叶螨对联苯唑草酯亚致死胁迫的分子响应机制，本研究重点关注了在昆虫耐受性中起重要作用的组织蛋白酶L基因。首先，通过叶片浸渍法测定了亚致死浓度（LC₁₀ = 0.481 mg·L^?1 和 LC₃₀ = 2.292 mg·L^?1）。随后，对亚致死处理的螨虫进行了转录组测序，鉴定出五个组织蛋白酶L基因（TuCTS-L1 至 TuCTS-L5）。表达模式分析显示，所有基因在LC₁₀ 和 LC₃₀ 处理后24小时达到峰值，随后下降，其中TuCTS-L2 的上调最为显著。系统发育分析证实这些基因属于溶酶体组织蛋白酶L家族。功能验证实验表明，RNA干扰（RNAi）能够特异性沉默TuCTS-L2，效率为78.7 ± 1.4％，显著降低了Tetranychus urticae的存活率，并增强了其对联苯唑草酯的敏感性，同时显著增加了死亡率。本研究表明，组织蛋白酶L基因，特别是TuCTS-L2，在二斑叶螨对亚致死浓度胁迫的响应中起功能性作用。这为理解杀螨剂的亚致死效应提供了新的见解，并为针对该基因的耐受性管理和绿色控制策略的开发奠定了理论基础。

引言

二斑叶螨（Tetranychus urticae Koch（蜱螨目：叶螨科）是一种全球分布广泛、生态适应性强的主要农业害虫。其寄主范围包括70多个科的1275多种植物，其中包括许多经济作物和观赏植物，对田间作物、花卉、蔬菜和果树构成严重威胁（Nie等人，2023年）。T. urticae的防治主要依赖于化学农药。然而，其快速的繁殖速度、高适应性和短生命周期使其容易产生耐受性，导致防治效果不佳（Fotoukkiaii等人，2020年）。

杀虫剂和杀螨剂的广泛使用推动了全球许多害虫和螨虫种群的耐受性进化。这种日益严重的耐受性在农业和公共害虫中普遍存在，极大地增加了防治工作的复杂性。耐受性的发展是一个复杂的过程，受遗传背景、生物特性、生态适应性和管理实践的影响。其机制是多方面的，主要发生在生化和分子水平。这些机制包括减少农药接触或渗透、增强代谢解毒、分泌和排泄，以及降低靶位点的敏感性或发生突变（Adesanya等人，2020年；Cao等人，2025年；Chen等人，2025年；Leeuwen等人，2010年；Leeuwen和Dermauw，2016年；Wei等人，2016年）。

组织蛋白酶属于半胱氨酸蛋白酶家族，是真核细胞溶酶体中的关键水解酶。它们在蛋白质降解中起核心作用，对维持细胞稳态至关重要，包括废物清除、蛋白质周转和自噬。此外，组织蛋白酶还参与免疫、代谢和繁殖等关键生理功能（Boulange等人，2001年；Wu等人，2003年）。已在昆虫中鉴定出多种组织蛋白酶基因。其中，组织蛋白酶L作为一种重要的消化蛋白酶，与对农药胁迫的响应有关。例如，亚致死浓度的吡虫啉和氯吡硫磷会抑制Diaphorina citri中的组织蛋白酶L表达（Shu等人，2022年），而印楝素处理会通过Spodoptera frugiperda Sf9细胞中的组织蛋白酶L加剧细胞凋亡（Wang等人，2015年）。

联苯唑草酯是一种新型的羧酸酯类杀螨剂，对螨虫的所有发育阶段均有效。它具有低哺乳动物毒性、高效力和长残效期，且与其他常用杀螨剂无交叉抗性。作为在中国草莓上注册的关键化合物，联苯唑草酯已被广泛用于防治多种植食性螨虫（Chang等人，2020年；Peng等人，2021年）。然而，在田间应用中，其初始浓度会随时间降低至亚致死水平（Shang等人，2022年；Xia等人，2024年）。这种亚致死暴露可以诱导害螨的各种生理和行为变化，可能促进耐受性的发展（Desneux等人，2007年）。我们实验室之前的研究已经探讨了亚致死浓度联苯唑草酯对T. urticae生长、发育和代谢酶活性的影响。然而，组织蛋白酶L在这种害虫中对联苯唑草酯耐受性的具体作用尚不清楚。

因此，本研究采用转录组测序、RT-qPCR和RNA干扰（RNAi）技术来鉴定和功能表征T. urticae中的组织蛋白酶L基因。我们的目标是阐明这些基因对联苯唑草酯亚致死浓度的分子响应机制。研究结果为理解T. urticae的耐受性机制提供了理论基础，并为合理使用联苯唑草酯以延长其有效寿命提供了科学依据。

螨虫培养

螨虫培养

二斑叶螨（T. urticae）的菌株最初于2012年5月从中国甘肃省兴龙山采集。该菌株在中国甘肃省农业大学植物保护学院的昆虫系统学与生物多样性实验室中，在Phaseolus vulgaris叶片上维持培养。螨虫在25 ± 1°C、60 ± 5%相对湿度和16:8光照:暗周期的受控条件下饲养（Wei等人，2024年）。培养过程中未使用任何化学药剂。

联苯唑草酯对T. urticae的毒性

使用叶片浸渍生物测定法测定了联苯唑草酯对成年雌性T. urticae的急性毒性。暴露48小时后的计算LC₁₀和LC₃₀值分别为0.481 mg/L和2.292 mg/L。选择这两个亚致死浓度进行后续实验，以研究螨虫的胁迫反应，而不会导致高死亡率。为了揭示整体分子响应，我们对暴露于LC₁₀和LC₃₀联苯唑草酯的螨虫进行了转录组测序。

讨论

由于长期和不科学的施药方式，二斑叶螨这种全球普遍存在的农业害虫已经对化学农药产生了显著的耐受性，使其防治变得越来越困难。亚致死剂量的农药暴露反而可能加速这些螨虫的耐受性发展（Ahmed等人，2025年；Gandara等人，2024年）。由于联苯唑草酯仍然是控制T. urticae的关键杀螨剂，因此了解其亚致死效应至关重要。

CRediT作者贡献声明

王月：方法学、研究、数据管理、概念构建、写作——审阅与编辑、初稿撰写。 聂鹏程：方法学、研究、概念构建、写作——审阅与编辑。 魏斌：研究、数据管理、写作——审阅与编辑。 刘学春：资源准备、研究、写作——审阅与编辑。 余鹏亮：资源准备、研究、写作——审阅与编辑。 肖俊和：资源准备、研究、写作——审阅与编辑。 陈尧年：

出版同意

不适用。

伦理批准和参与同意

不适用。

资助

本研究得到了甘肃省农业大学学生创新与创业培训计划（项目编号：202513061）和甘肃省农业大学植物保护学院农业昆虫与害虫控制学科关键团队建设基金（项目编号：GSAU-XKJS-2023）的支持。

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利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

致谢

不适用。