《Pharmacological Research - Modern Chinese Medicine》：Component identification and ameliorative effect of amyloid-β-induced toxicity in transgenic
Caenorhabditis elegans of Ershiwuwei Zhenzhu pills
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阿尔茨海默病(AD)尚无有效治疗药物。本研究针对藏族经典方剂二十五味珍珠丸（EZP），筛选其有效提取物，并在转基因秀丽隐杆线虫(C. elegans)模型中，探究了其水提物（WE-EZP）减轻β-淀粉样蛋白（Aβ）毒性、抑制斑块沉积的神经保护作用及潜在机制，为开发基于传统药物的AD治疗新策略提供了实验依据。
想象一下，我们的大脑就像一个精密运转的城市网络。然而，有一种名为阿尔茨海默病（Alzheimer's disease, AD）的“侵蚀者”，正在全球范围内侵袭越来越多老年人的“记忆之城”。根据2024年《世界阿尔茨海默病报告》的预测，到2050年，全球痴呆症患者人数将从2019年的5500万激增至惊人的1.39亿。这种疾病不仅夺走患者的记忆与认知，也给家庭和社会带来沉重负担。更令人忧心的是，目前临床上用于治疗AD的药物，无论是N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartate, NMDA）受体拮抗剂还是乙酰胆碱酯酶抑制剂，都只能在一定程度上缓解轻度至中度患者的症状，既无法阻止病情进展，更无法逆转疾病。寻找能够真正干预AD病理进程的有效疗法，已成为生命科学与医学领域迫在眉睫的挑战。
在AD复杂交织的致病假说网络中，β-淀粉样蛋白（Amyloid-β, Aβ）假说占据着核心位置。该假说认为，Aβ肽的产生与清除失衡导致其在大脑中异常积累，形成老年斑，并最终引发神经元损伤和认知功能衰退。因此，靶向Aβ的生成、聚集和清除，成为AD药物研发的热点方向。与此同时，传统医学的宝库也为现代新药探索提供了丰富的灵感源泉。二十五味珍珠丸（Ershiwuwei Zhenzhu pills, EZP）是一种源自藏医经典《四部医典》的复方制剂，被收录于《中华人民共和国药典》，在临床上广泛应用于治疗血管性痴呆、缺血性脑卒中等多种心脑血管与神经系统疾病。前期研究表明，EZP具有神经保护、抗炎和抗氧化等多种活性，其组方中的藏红花、肉桂、肉豆蔻、丁香等单味药材也被报道具有抗AD潜力。这不禁让研究人员思考：这个古老的藏药复方，是否也能成为对抗现代顽疾——阿尔茨海默病——的一把新钥匙？
为了回答这个关键问题，兰州大学药学院的研究团队在Xin Wang、Dong-Qing Fei等研究人员的带领下，开展了一项系统性研究，相关成果发表在《Pharmacological Research - Modern Chinese Medicine》上。他们以转基因秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans, C. elegans）这一在神经退行性疾病研究中被广泛应用的模式生物为载体，深入探究了EZP对抗Aβ毒性的效果及其作用机制，为传统药物的现代化开发提供了扎实的科学证据。
研究采用的关键技术方法：
本研究综合利用了多种技术手段。首先，通过不同溶剂（水、石油醚、乙醇等）的索氏提取法制备了EZP的六种提取物，并利用超高效液相色谱-四极杆飞行时间串联质谱（UPLC-Q-TOF-MS/MS）对活性最佳的水提物（WE-EZP）进行了化学成分鉴定。在药效评价方面，研究使用了三种转基因秀丽隐杆线虫模型：在肌肉细胞表达Aβ并导致瘫痪的CL4176品系、在泛神经元表达Aβ并导致5-羟色胺（5-hydroxytryptamine, 5-HT）超敏的CL2355品系，以及组成性表达Aβ并形成斑块的CL2006品系，分别用于评估药物延缓瘫痪、改善神经毒性和减少Aβ沉积的效果。机制探索则结合了网络药理学分析（整合TCMSP、SwissTargetPrediction、PharmMapper等数据库预测靶点，并通过STRING数据库构建蛋白质-蛋白质相互作用网络）和分子生物学验证（实时荧光定量PCR, qRT-PCR）等手段。
研究结果：
3.1. 通过UPLC-Q-TOF-MS/MS鉴定WE-EZP中的化学成分
研究人员首先对活性提取物WE-EZP进行了“身份普查”。利用高分辨质谱技术，他们在WE-EZP中共鉴定出101种化合物。其中，有机酸（22种）、黄酮类（25种）和异黄酮类（21种）是含量最丰富的三类成分，其余还包括生物碱、多酚、糖类、萜类等。这些已知具有抗氧化、抗炎、抗淀粉样变等多种生物活性的成分，为后续观察到的药效提供了物质基础。
3.2. EZP提取物延缓转基因AD线虫的Aβ诱导性瘫痪
面对六种不同的EZP提取物，哪种才是对抗Aβ的“精锐部队”？研究团队使用了经典的CL4176线虫模型进行初筛。这种线虫在温度升高后，会在肌肉细胞中大量产生Aβ，最终导致全身瘫痪。结果显示，水提物（WE-EZP, 5 mg/mL）、水层组分（AE-EZP, 5 mg/mL）、石油醚层组分（PEE-EZP, 0.1 mg/mL）和乙酸乙酯层组分（EAE-EZP, 0.1 mg/mL）均能显著延缓线虫的瘫痪进程。其中，WE-EZP在1-6 mg/mL浓度范围内呈现剂量依赖性的保护效果，其作用甚至与一线AD治疗药物美金刚胺（memantine）效果相当。
3.3. WE-EZP改善转基因AD线虫的Aβ诱导神经毒性
AD的核心病变发生在神经元。为了验证WE-EZP能否保护神经元免受Aβ毒害，研究人员使用了CL2355品系。该品系线虫在神经元中表达Aβ，导致其对神经递质5-HT异常敏感。实验发现，经WE-EZP（2-6 mg/mL）处理后，CL2355线虫对5-HT的敏感性显著降低，瘫痪比例从72.47%大幅下降至43.59%（6 mg/mL组）。同时，在另一个表达绿色荧光蛋白（GFP）的对照品系CL2179中，WE-EZP处理并未影响GFP的荧光强度，表明其保护作用特异性地针对Aβ，而非非特异性地抑制所有外源转基因的表达。
3.4. WE-EZP减少转基因线虫中的Aβ沉积
WE-EZP是如何发挥保护作用的？是减少了Aβ的“产量”，还是加快了它的“清理”？为了回答这个问题，研究转向了CL2006品系。这种线虫持续表达Aβ并形成类似老年斑的沉积物，可以用硫代黄素S（Thioflavin S, ThS）进行染色标记。令人振奋的结果出现了：WE-EZP处理能剂量依赖性地减少线虫头部Aβ斑块的数量，在6 mg/mL浓度下，斑块数量比对照组降低了61.7%。进一步的分子检测发现，WE-EZP还能下调Aβ的mRNA表达水平。这表明，WE-EZP既能从“源头”上抑制Aβ的生成，也能减少其最终的“堆积”。
3.5. EZP抗AD核心基因的网络药理学分析
面对EZP这样一个由27味药材组成的复杂体系，其作用机制如同一个复杂的网络。研究团队运用网络药理学方法，试图描绘出这个网络的“关键节点”。他们从EZP中筛选出123个活性成分，预测了314个潜在作用靶点，并与1255个AD疾病靶点取交集，得到了199个候选靶点。对这些靶点进行蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络分析后，锁定了六个枢纽基因：daf-16, hsp-90, daf-2, let-23, age-1和 daf-18。值得注意的是，daf-16, daf-2, age-1, daf-18以及另一个关键基因 skn-1，都是进化上保守的胰岛素/胰岛素样生长因子-1信号（Insulin/IGF-1 Signaling, IIS）通路的核心组件，该通路是调控寿命和应激反应的主要通路。这强烈提示IIS通路是EZP发挥作用的关键机制靶标。
3.6. EZP通过上调daf-16, skn-1和 bec-1的表达发挥抗Aβ效应**
网络药理学分析给出了“地图”，还需要实验来验证“路径”。对候选靶点的基因本体（Gene Ontology, GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）通路富集分析显示，EZP的作用与“FoxO信号通路”、“长寿调节通路”以及“自噬-动物”通路等密切相关。这些通路分别关联到抗氧化应激系统和自噬系统。Aβ的积累会引发氧化应激，而氧化应激又会反过来加剧Aβ的聚集，形成恶性循环。同时，自噬是细胞清除错误折叠蛋白（如Aβ）的重要“垃圾处理”系统。研究团队通过qRT-PCR检测了相关基因的表达，发现WE-EZP处理能上调抗氧化关键转录因子daf-16（FoxO的同源基因）和skn-1（Nrf2的同源基因），以及自噬相关基因bec-1的表达。这意味着，WE-EZP很可能通过激活机体的抗氧化防御体系和增强自噬清理能力，来对抗Aβ毒性。
研究结论与重要意义
综上所述，这项研究系统性地揭示了传统藏药二十五味珍珠丸在对抗阿尔茨海默病核心病理蛋白Aβ毒性方面的潜力与机制。研究首先从六种提取物中筛选出活性显著的水提物（WE-EZP），并鉴定出其富含黄酮、有机酸等活性成分。利用多种转基因线虫模型，研究证实WE-EZP不仅能剂量依赖性地延缓Aβ诱导的瘫痪、改善神经毒性，还能特异性地减少Aβ斑块沉积并降低其mRNA表达水平。通过整合网络药理学分析与实验验证，研究将EZP的神经保护作用与调节氧化应激反应和自噬通路联系起来，发现其可能通过上调daf-16, skn-1和 bec-1等关键基因的表达来发挥作用。
这项研究的重要意义在于，它首次在模式生物水平为EZP抗AD提供了详实的实验证据，将传统药物的临床应用经验与现代分子病理学机制进行了有效衔接。它不仅证实了EZP多组分、多靶点的作用特点，更重要的是，将具体的作用机制聚焦于抗氧化和自噬这两条在AD发病中至关重要的通路上，为理解复杂传统复方的药理学原理提供了范例。当然，研究作者也指出了当前工作的局限性，例如需要在基因敲低模型中进行更深入的机制验证，以及最终在哺乳动物模型中确认疗效。尽管如此，这项研究无疑为开发基于二十五味珍珠丸或其活性成分的阿尔茨海默病治疗新策略奠定了坚实的基础，也为从传统医学宝库中挖掘现代疾病治疗方案开辟了一条富有希望的道路。
