《Phytomedicine》：Modified Shenlingbaizhu Decoction suppresses colon cancer via enhancing memory-like Tfh differentiation and B cell responses
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微卫星稳定结直肠癌（MSS COAD）免疫治疗响应差，本研究通过单细胞测序发现改良参苓白术散（MSD）促进记忆型Tfh细胞和B细胞在肿瘤相关聚集物（TAA）中形成协同效应，其机制依赖CCL20/CXCL13趋化通路，抑制EMT并增强Tfh细胞干细胞特性，恢复B细胞分化为浆细胞及IgG分泌。
姜国荣|闫新怡|郑月云|庄琳琳|刘长顺|张佳轩|刘景和|钟博军|孙学刚
中国广东省广州市南方医科大学中医药学院分子生物学重点实验室，邮编510515
摘要
背景
免疫检查点抑制剂（ICI）在晚期临床试验中对微卫星稳定（MSS）结直肠癌患者的疗效较差。对于以T细胞浸润不足为特征的肿瘤类型而言，开发有效的治疗策略以增强和延长抗肿瘤活性仍然是一个重大挑战。
目的
本研究旨在探讨改良型参苓白术汤（MSD）是否能够调节肿瘤微环境（TME）中的抗肿瘤免疫反应。
方法
通过高效液相色谱（HPLC）分析对MSD提取物的成分进行了鉴定。采用单细胞RNA测序（scRNA-seq）、流式细胞术分析和免疫荧光技术来解析MSS小鼠模型中的免疫景观。使用酶联免疫吸附测定（ELISA）检测血清IgG的浓度。
结果
MSD通过增加小鼠结肠腺癌（COAD）肿瘤中的记忆样滤泡辅助T细胞（Tfh）和B细胞来促进抗肿瘤免疫，而非通过CD8+ T细胞或髓系细胞。scRNA-seq分析结果表明，MSD增强了CCL20和CXCL13的分泌。中和CCL20会削弱MSD促进高内皮静脉（HEV）相关B细胞向肿瘤巢迁移并促进肿瘤相关聚集物（TAAs）形成的作用。B细胞的耗竭减少了记忆样Tfh细胞的生成并降低了其干性，从而减弱了MSD在COAD小鼠中的治疗效果。在二次免疫反应中，记忆样Tfh细胞能够迅速转变为效应状态，促进B细胞分化为浆细胞并增强IgG抗体的分泌。机制上，MSD上调了Tfh细胞中的Jarid2表达。敲低Tfh细胞中的Jarid2会导致记忆样Tfh细胞数量减少及其干性降低，并降低与B细胞相互作用的关键受体ICOS的表达。
结论
B细胞与记忆样Tfh细胞之间的相互作用对于治疗MSS COAD具有潜在的免疫疗效。MSD通过CCL20依赖的方式促进了Tfh细胞与B细胞的协作，从而增强了肿瘤相关聚集物的形成。
引言
肿瘤微环境（TME）由肿瘤、基质细胞和内皮细胞组成，由于肿瘤与先天性和适应性免疫细胞之间的复杂相互作用而具有高度异质性（van Weverwijk和de Visser，2023）。针对T细胞介导的免疫的免疫疗法彻底改变了癌症治疗方式。接受ICI治疗的患者长期生存率比接受化疗的患者高出约10%（Lin等人，2022）。然而，只有少数患者（10-40%）对PD-L1/PD-1抗体表现出持久的反应（Chen和Mellman，2017）。MSS转移性结直肠癌对ICI反应不佳的一个原因是其“冷”癌症的免疫荒漠表型（Cai等人，2024）。因此，需要更全面地理解癌症免疫机制，特别是解决非响应性MSS癌症表型的整体免疫特征。scRNA-seq揭示了不同癌症中T细胞和B细胞的独特亚型和功能，以及它们相互作用在肿瘤生长中的调节作用（Fitzsimons等人，2024；Huang等人，2022；Yang等人，2024；Zhang等人，2018）。CD8?细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）能够识别肿瘤抗原，直接杀死癌细胞，并分泌IFN-γ、TNF-α和IL-2等细胞因子以抑制肿瘤进展（Hoekstra等人，2021）。CD4?辅助T细胞可增强CTL活性，促进巨噬细胞活化，并抑制肿瘤血管生成（Xie等人，2023）。值得注意的是，T细胞和B细胞在肿瘤的免疫调节过程中密切相关。在人类非小细胞肺癌（NSCLC）肿瘤组织中，B细胞位于幼稚T细胞和记忆T细胞亚群附近，而浆细胞则倾向于与调节性T细胞（Tregs）共定位，并更靠近肿瘤细胞（Fitzsimons等人，2024）。观察到CD20? B细胞浸润与结直肠癌患者的生存率呈正相关，这可能归因于CD20? B细胞与周围CD3? T细胞在肿瘤床和侵袭边缘形成小的淋巴样结构（TLSs）（Ji等人，2024）。TLSs主要由B细胞和滤泡辅助T细胞（Tfh）组成的生发中心（GCs）、周围的T细胞区域以及分布的PNAd?高内皮静脉（HEV）构成（Zhao等人，2024a）。Tfh细胞的分化由诱导性共刺激因子（ICOS）启动。激活后，Tfh细胞表达CXCR5并产生CXCL13，吸引CXCR5+ B细胞和其他细胞（如树突状细胞、巨噬细胞、成纤维细胞）到炎症部位或肿瘤处，形成TLSs。CXCR5+ Tfh细胞还分泌IL-21、IL-4和IL-10等细胞因子，促进GCs的形成（Hoellwerth等人，2023；Zhao等人，2024a）。
参苓白术散（SBS）能够有效抑制或延缓结直肠癌的生长（Lin等人，2015）。脾虚是结直肠癌免疫逃逸的关键病理机制。增强脾功能的中药具有逆转肿瘤免疫逃逸的潜力。利用健脾草药调节TME可能代表中药预防和治疗癌症的新方法（Sun等人，2016）。改良型参苓白术汤（MSD）通过抑制TGF-β/Smad信号诱导的上皮-间充质转化（EMT）过程，从而抑制结直肠癌的生长（Dai等人，2022）。此外，MSD治疗显著减少了小鼠的肠腺瘤数量和大小、黏膜增厚以及脾脏大小（Xu等人，2018）。然而，MSD在消化系统疾病中的免疫调节机制尚未得到充分阐明。因此，我们建立了小鼠结肠腺癌（COAD）模型，并通过scRNA-seq研究MSD是否以及如何通过调节T细胞分化和TME中的细胞-细胞相互作用来抑制COAD的进展。
MSD的组成和设计逻辑
MSD包含十三种常用中药：人参（Panax ginseng C. A. Mey.）、茯苓（Wolfiporia cocos (Schwein.) Ryvarden & Gilb.）、白术（Atractylodes macrocephala Koidz.）、五爪龙（Ficus hirta Vahl.）、肉苁蓉（Cistanche deserticola Y. C. Ma）、莪术（Curcuma phaeocaulis Val.）、薏苡仁（Coix lacryma-jobi var. ma-yuen (Roman.) Stapf）、椿皮（Ailanthus altissima (Mill.) Swingle）、山鸡葛（Cremastra appendiculata (D.Don) Makino）、山药（Dioscorea opposita Thunb.）、桔梗（Platycodon
确定MSD HPLC指纹图谱中特征峰的草药来源并量化活性成分
使用HPLC对MSD成分进行了鉴定。MSD的指纹图谱在不同测试样本中表现出良好的重复性（图1A）。为了确认MSD指纹图谱中显著峰（峰A–G）的中药来源，也将MSD的十三种组成草药进行了相同的HPLC分析（图1B）。结果表明，峰A最可能来源于白术，峰B来源于椿皮，峰C来源于肉苁蓉。峰D、E和G最可能来源于陈皮，峰F
讨论
CT26 COAD模型属于MSS类型，通常对免疫疗法不敏感（Fang等人，2022）。这些肿瘤通常具有较高的免疫抑制细胞（Tregs和MDSC）浸润。鉴于αCTLA4能够抑制Tregs和MDSC的功能，并影响Tfh的分化（Osaki和Sakaguchi，2025；Yu等人，2022），我们选择它作为阳性药物组。我们的初步假设是MSD可能增强T细胞浸润，从而弥补ICI的不足
结论
MSD能够调节小鼠COAD肿瘤中Tfh细胞的分化及其对B细胞免疫反应的辅助作用。这一过程主要是通过MSD增强CCL20和CXCL13的分泌来实现的，从而协同促进肿瘤相关聚集物（TAA）的形成。B细胞的耗竭减少了记忆样Tfh细胞的生成及其干性，从而降低了MSD对小鼠COAD肿瘤的治疗效果。总之，MSD增强了记忆样Tfh细胞的干性，从而增强了B细胞的
作者贡献
姜国荣：概念构思、方法学、验证、软件、撰写——原始草稿。闫新怡：方法学、验证、软件。郑月云：方法学、验证。庄琳琳：方法学、验证。刘长顺：方法学。张佳轩：方法学。刘景和：可视化。钟博军：软件。孙学刚：监督、项目管理、撰写——审稿与编辑、资金获取。
资助
本研究得到了国家自然科学基金（82574892、82274387）、国家重点研发计划（2023YFC3502802、2025ZD0545102）、广东省教育厅研发计划（2022ZDZX2008）以及广州市科学技术局重点研发计划（SL2023B03J00735）的支持。
CRediT作者贡献声明
姜国荣：撰写——原始草稿、验证、方法学、概念构思。闫新怡：验证、软件、方法学。郑月云：验证、方法学。庄琳琳：验证、方法学。刘长顺：方法学。张佳轩：方法学。刘景和：可视化。钟博军：软件。孙学刚：撰写——审稿与编辑、监督、项目管理、资金获取。
