《Poultry Science》：Toxicological profile and hepatotoxic mechanism of
Caulis sinomenii for safe application in chickens
编辑推荐：
为了解决青藤(Caulis sinomenii)作为潜在兽药在禽痛风防治中的安全性问题，研究人员通过优化提取工艺获得了其乙醇提取物(CS)，并综合运用急性和亚急性毒性实验、组织病理学评估及网络毒理学分析，系统评估了CS在鸡体内的毒理特性、安全剂量和肝毒性分子机制，为青藤在禽病防治中的安全应用提供了关键科学依据和剂量指导。
在现代家禽养殖业中，为了提高生产效率，集约化养殖模式与高钙高蛋白饲料被广泛应用，但这却导致了一个棘手的问题——禽痛风的发病率显著攀升。禽痛风不仅会给鸡群带来巨大的痛苦，导致其死亡率高达50%，也给家禽业造成了严重的经济损失。青藤(Caulis sinomenii)作为一种传统中药，在治疗人类风湿性关节炎和肾脏疾病方面已得到验证，在防治禽痛风方面展现出巨大的潜力。然而，这把潜在的“兽医新武器”安全性究竟如何？它在鸡体内的毒副作用是怎样的？安全剂量又是多少？这些关键问题却鲜有研究，知识的空白可能直接导致兽医临床上的不当使用，甚至引发中毒风险。因此，为了填补这一空白，确保其安全、合理地应用于家禽疾病防治，一项针对青藤提取物在鸡体内安全性的系统性研究应运而生，其研究成果发表在《Poultry Science》上。
为了回答上述问题，研究人员运用了多项关键的技术方法。他们首先通过单因素设计(SFD)和响应面法(RSM)优化了青藤的乙醇提取条件，以获得稳定的提取物(CS)。随后，利用高效液相色谱法(HPLC)分析了CS的化学成分，并检测了其口服后在鸡体内的血中移行成分及血浆浓度。在鸡模型上，研究人员系统性地开展了急性毒性实验和为期14天的亚急性毒性实验，以确定半数致死剂量(LD50)和安全剂量范围。在实验过程中，他们每日检查鸡只的一般表现，并通过自动血球分析仪和生化分析仪进行了全面的血液学检测和血清生化指标检测。实验结束后，收集了心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏和肠道等组织，进行组织称重以计算脏器指数，并制作石蜡切片进行苏木精-伊红(H&E)染色，通过光学显微镜进行组织病理学评估，以观察结构损伤。最后，为了深入探究其毒性机制，研究人员采用了网络毒理学分析方法，通过检索多个数据库获取成分靶点和肝毒性靶点，构建“药物-成分-靶点-疾病”网络，进行蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络分析、基因本体(GO)功能富集分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析，并进一步通过分子对接验证关键成分与核心靶点的结合。
结果
优化提取条件为70.35%乙醇、液固比20.26:1 mL/g、温度81.61°C和时间154.71 min
研究人员首先建立了测定生物碱含量的标准曲线，并通过单因素设计初步确定了最佳提取参数。随后，基于响应面法构建的模型具有高度显著性，预测了最佳提取条件。在此条件下，青藤提取物(CS)的理论得率为203.04 mg/g，与实际得率误差仅为1.37%，验证了优化工艺的可行性与良好的拟合性能。
CS包含约13种成分，其中7种在鸡灌胃后可在血液中检测到
经提取、浓缩和冻干后，最终获得的CS粉末呈土黄色。HPLC分析显示，CS中含有13个清晰的色谱峰，推测对应13种不同的化合物成分。通过比较给药后不同时间点的鸡血浆HPLC图谱，发现有7种成分被吸收进入血液，包括β-谷甾醇、16-epi-isositsirikine、木兰花碱、千金藤啶碱、青藤碱、木兰苷内酯和含笑内酯。各成分达到最大血药浓度的时间各不相同，显示其不同的药代动力学特性。
CS在鸡口服后属于低毒物质
通过急性毒性实验确定了CS在鸡口服后的半数致死剂量(LD50)为1018.83 mg/kg，根据急性毒性分级标准，CS被归类为低毒物质。实验观察到了剂量依赖性的中毒症状和死亡情况。血液常规检测发现，高剂量组（1400.00 mg/kg）的白细胞(WBC)计数显著升高，而所有实验组和阳性对照组的血小板(PLT)计数均显著低于阴性对照组，并呈剂量依赖性下降，提示CS可能影响凝血功能。
CS引起鸡肝脏和心脏功能异常
为期14天的亚急性毒性实验显示，中、高剂量组鸡的体重增长趋于停滞。血液学指标中，血小板计数仍呈剂量依赖性下降趋势。血清生化指标分析发现，与肝功能相关的碱性磷酸酶(ALP)水平在高剂量组显著低于其他组。与心脏功能相关的指标中，低剂量组的肌酸激酶(CK)水平显著升高，而高剂量组的乳酸脱氢酶(LDH)水平显著高于阴性对照组和阳性对照组。此外，中、高剂量组的血清钠(Na)和氯(Cl)水平也出现显著变化。这些结果表明，CS可能引起肝脏和心脏的功能性异常。
CS引起鸡肝脏和肠道结构损伤
组织病理学评估结果显示，肺、脾、肾、心脏未观察到显著的病理变化，但其脏器指数在部分实验组有升高。肝脏方面，高剂量组的肝脏指数显著增加，并且中、高剂量组的肝组织坏死面积比例显著高于阴性对照组和低剂量组。肠道方面，虽然肠道指数无显著差异，但中、高剂量组的肠绒毛长度显著增加，而肠隐窝深度则呈剂量依赖性显著降低。这些数据表明，CS对肝脏和肠道造成了结构性的损伤。
通过三条主要成分与核心靶点HTR2A、NTRK1和TLR7的相互作用，多通路参与了CS诱导的肝毒性
网络毒理学分析揭示了三个关键成分——含笑内酯、木兰苷内酯和16-epi-isositsirikine——是CS诱导肝毒性的主要贡献者。共筛选出61个成分与肝毒性的交集靶点。蛋白质-蛋白质相互作用网络和拓扑参数分析提示，JUN、PRKCB、PRKCA、MAPK14、NTRK1、MAPK8、HTR2A和TLR7可能是与肝损伤相关的核心靶点。通路富集分析表明，这些交集靶点显著富集于Toll样受体信号通路、MAPK信号通路、缝隙连接和细胞凋亡等26条信号通路。分子对接结果显示，三个关键成分与8个核心靶点均能稳定结合（结合能 < -6.00 kcal/mol）。机制分析图综合表明，16-epi-isositsirikine可通过激活NTRK1或HTR2A受体，进而调控下游的MAPK（丝裂原活化蛋白激酶）级联反应，诱导肝细胞凋亡和炎症；木兰苷内酯可通过激活Ras蛋白或TLR7，启动MyD88依赖性通路，加剧肝细胞凋亡和炎症反应；含笑内酯则通过刺激PRKCA和PRKCB激活Ras蛋白，并作用于JUN介导肝细胞凋亡。
结论与讨论
本研究成功优化了青藤乙醇提取物的制备工艺，明确了其口服后在鸡体内的主要血中移行成分。毒理学评价表明，CS属于低毒物质，口服LD50为1018.83 mg/kg，并确定了其安全剂量（≤ 127.35 mg/kg）和毒性剂量（≥ 254.71 mg/kg）。研究发现，过量使用CS会对循环系统（如影响血小板）和消化系统（如肝脏和肠道）的结构与功能造成损伤。机制研究进一步揭示，含笑内酯、木兰苷内酯和16-epi-isositsirikine是导致肝毒性的关键成分，它们通过作用于HTR2A、NTRK1和TLR7等核心靶点，调控下游的MAPK等信号通路，最终引发肝细胞损伤。尽管本研究为CS在禽类生产中的安全剂量指南奠定了科学基础，但其结论主要基于鸡模型，在其他禽类中的普适性仍需验证，且肝毒性的分子基础仍需在细胞和分子水平进行更深入的探究。
这项研究的重要意义在于，它系统性地评估了青藤这一传统中药作为潜在禽用兽药的安全性，不仅提供了关键的毒理学参数和安全剂量范围，还深入揭示了其可能造成肝损伤的分子机制。这为未来在兽医临床中安全、有效地应用青藤及其提取物防治禽痛风等疾病提供了直接、重要的科学依据。研究人员建议，为确保安全有效的临床应用，CS的使用剂量应严格限制在不超过200 mg/kg，并需定期监测肝脏和肠道功能。
