《Poultry Science》：Natural astaxanthin enhances testosterone synthesis by improving mitochondrial function and reducing oxidative stress in Leydig cells
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本研究聚焦于家禽养殖中老龄公鸡繁殖性能下降的核心难题。为解决衰老引发的氧化应激与线粒体功能障碍导致的Leydig细胞睾酮合成能力衰退问题，研究团队系统探究了天然虾青素(ASTA)对老龄公鸡睾丸Leydig细胞的作用。结果表明，ASTA可通过减轻氧化应激、改善线粒体功能和生物合成、上调类固醇合成关键基因表达及抑制线粒体相关凋亡等多重机制，有效提升Leydig细胞活力与睾酮合成。这为利用ASTA作为一种天然饲料添加剂，以改善和延长种用公鸡繁殖寿命提供了重要的理论依据和应用前景。
“男人四十一枝花”，但对于家禽界的“公鸡先生”来说，年龄增长带来的烦恼却十分现实。在肉鸡和蛋鸡的种禽繁育体系中，年过“50周龄”的公鸡往往会面临“中年危机”——其精子质量、血液中关键的雄性激素睾酮水平以及睾丸功能会急剧下降，直接导致种蛋受精率和孵化率大打折扣，严重影响养殖业的经济效益。这背后的“元凶”是谁？科学界逐渐将目光聚焦于睾丸中一种名为Leydig细胞（睾丸间质细胞）的特殊细胞。它们是体内约95%睾酮的“生产车间”，对氧化应激极为敏感。随着年龄增长，细胞内的“能量工厂”线粒体功能衰退，产生过多的活性氧(ROS)，如同“生锈”一般，损害细胞结构，抑制关键合成酶的活性，最终导致睾酮“停产”。那么，有没有一种安全有效的“保养剂”，能为这些“衰老”的Leydig细胞“减龄”，重振其“生产力”呢？
一种名为虾青素(ASTA)的天然物质进入了研究者的视野。它是一种存在于雨生红球藻、磷虾等生物中的红色类胡萝卜素，拥有强大的抗氧化“本领”。先前在禽类上的研究表明，在饲料中添加ASTA可以改善老龄公鸡的精液质量和睾酮水平。然而，ASTA究竟是如何在细胞层面，特别是在睾酮合成的“核心车间”Leydig细胞内发挥作用的？其具体的分子机制，尤其是如何“修复”受损的线粒体以促进激素合成，仍然是一个“黑箱”。为了解开这个谜团，来自北京农业大学的科研团队在《Poultry Science》上发表了一项研究，深入探究了ASTA对老龄公鸡Leydig细胞睾酮合成的影响及其背后的多重机制。
研究人员为开展这项研究，运用了几个关键的技术方法。首先，他们从65-70周龄的“京红1号”老龄公鸡睾丸中成功分离并培养了原代Leydig细胞，并通过3β-羟基类固醇脱氢酶(3β-HSD)组织化学染色验证了细胞纯度高于95%。在此基础上，他们利用CCK-8法评估了不同浓度ASTA对细胞活力的影响，并通过酶联免疫吸附测定(ELISA)检测了细胞培养上清中的睾酮含量。为了深入探究机制，他们采用流式细胞术结合DCFH-DA荧光探针检测了细胞内ROS水平，并使用JC-1荧光探针检测了线粒体膜电位(MMP)。同时，通过比色法试剂盒测定了超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)等抗氧化酶的活性以及丙二醛(MDA)含量。此外，研究还运用了定量实时聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测了包括类固醇合成酶、抗氧化相关基因、线粒体生物合成调控因子及凋亡相关基因在内的数十种基因的mRNA表达水平，并通过蛋白质免疫印迹法(Western blot)验证了相应关键蛋白的表达变化。最后，通过流式细胞术使用Annexin V-FITC/PI双染法分析了细胞凋亡率。
研究结果部分揭示了ASTA的多方面有益效应：
ASTA对细胞增殖活力和睾酮合成的影响
研究人员首先确认，在测试浓度范围内（最高50 μg/mL），ASTA对Leydig细胞无毒性，且能显著提高细胞活力。更重要的是，ASTA处理能显著促进睾酮分泌，在浓度为2.5至20 μg/mL时效果明显，其中5 μg/mL的促睾酮合成效果最为显著，但高浓度（40 μg/mL）反而会抑制睾酮合成。这表明ASTA对睾酮合成的促进作用存在一个最优剂量窗口。
ASTA对睾酮合成关键酶表达的影响
为了探究促睾酮合成的直接原因，研究检测了类固醇合成通路上的关键“工人”——几种关键酶。结果发现，5 μg/mL ASTA处理能显著上调类固醇合成急性调节蛋白(StAR)、胆固醇侧链裂解酶(P450scc)、3β-羟基类固醇脱氢酶(3β-HSD)和17β-羟基类固醇脱氢酶(17β-HSD)的mRNA和蛋白表达水平。此外，作为调控这些“工人”的“总指挥”——类固醇生成因子-1(SF-1)的表达也显著增加。这清晰地表明，ASTA通过激活SF-1，协调性地增强了整个睾酮合成“生产线”上各个关键环节的产能。
ASTA对氧化应激和抗氧化能力的影响
面对“衰老”细胞的核心问题——氧化应激，ASTA展现了其强大的抗氧化“实力”。5 μg/mL ASTA处理能显著降低Leydig细胞内的ROS水平，同时提升SOD、CAT、GSH-Px等主要抗氧化酶的活性及其基因（SOD1、SOD2、CAT、GPX1）的表达。反映脂质过氧化损伤程度的MDA含量也显著下降。不仅如此，ASTA还上调了细胞内两大抗氧化防御系统的“指挥官”——核因子E2相关因子2(Nrf2)和叉头框蛋白O1(FOXO1)的表达。这些结果共同证实，ASTA能有效强化Leydig细胞的整体抗氧化防御体系，减轻氧化损伤。
ASTA对线粒体功能、生物合成和细胞凋亡的影响
研究最核心的发现之一，在于ASTA对“能量工厂”线粒体的修复与重建。处理后的细胞线粒体膜电位(MMP)显著升高，细胞内能量货币三磷酸腺苷(ATP)的含量增加，线粒体DNA(mtDNA)的拷贝数也明显增多。这背后是线粒体生物合成过程的激活：ASTA上调了过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1α(PGC-1α)、核呼吸因子1(NRF1)和线粒体转录因子A(TFAM)等关键调控因子的表达。PGC-1α被称为线粒体生物合成的“主开关”，它激活NRF1和TFAM，共同促进新线粒体的生成和mtDNA的复制。同时，沉默信息调节因子1(SIRT1)的表达也显著增加，SIRT1可通过去乙酰化激活PGC-1α和FOXO1，从而在线粒体生物合成和抗氧化防御之间建立联系。
健康的线粒体是细胞存活的基础。研究表明，ASTA处理能显著抑制Leydig细胞的凋亡。其机制在于，ASTA下调了促凋亡蛋白Bcl-2相关X蛋白(Bax)、胱天蛋白酶-3(caspase-3)和凋亡诱导因子(AIF)的表达，同时上调了抗凋亡蛋白B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)的表达。这意味着ASTA通过改善线粒体功能和氧化还原态，稳定了线粒体外膜，防止了线粒体途径凋亡的启动，从而保护了Leydig细胞的数量和功能完整性。
归纳研究结论与讨论
综上所述，这项研究系统地阐明了天然虾青素促进老龄公鸡睾丸Leydig细胞睾酮合成的多维度、协同性作用机制。其核心结论可归纳为以下几点：
- 1.
有效性与最适剂量：ASTA在体外能安全有效地促进老龄公鸡Leydig细胞的睾酮合成，其中5 μg/mL为最适浓度。
- 2.
激活合成通路：ASTA通过上调核心转录因子SF-1的表达，进而协调性地上调StAR、P450scc、3β-HSD、17β-HSD等类固醇合成关键酶的基因和蛋白表达，直接强化了睾酮的生物合成通路。
- 3.
强化抗氧化防御：ASTA通过激活Nrf2和FOXO1信号轴，全面增强细胞内的抗氧化酶系统（SOD、CAT、GSH-Px），有效清除ROS，降低脂质过氧化产物MDA，为类固醇合成提供了一个稳定的氧化还原内环境。
- 4.
修复与重建线粒体：ASTA能显著改善线粒体功能，表现为MMP和ATP水平升高。更深层的机制在于，它通过激活SIRT1/PGC-1α信号通路，上调NRF1和TFAM的表达，促进了线粒体的生物合成，增加了mtDNA拷贝数，从“质”和“量”两方面重建了健康的线粒体网络，为高耗能的类固醇合成过程提供了充足的能量保障。
- 5.
抑制细胞凋亡：通过改善线粒体健康和氧化还原平衡，ASTA稳定了线粒体膜，抑制了Bax/caspase-3等介导的线粒体凋亡途径，上调了Bcl-2，从而减少了Leydig细胞的程序性死亡，保证了“生产车间”的存续。
在讨论中，研究者将这些机制串联成一个完整的逻辑链：ASTA如同一位“多面手”，它一方面通过激活SF-1“总指挥”来提升“生产线”（类固醇合成酶）的效能；另一方面，通过增强抗氧化防御（Nrf2/FOXO1）和修复能量工厂（SIRT1/PGC-1α/线粒体生物合成），为“生产线”创造了稳定、高能的运行环境；同时，通过抑制凋亡来保护“生产车间”（Leydig细胞）本身。这三重作用相辅相成，共同导致了睾酮合成效率的显著提升。
这项研究的重要意义在于，它首次在细胞和分子水平上，相对完整地揭示了ASTA改善禽类雄性生殖功能的深层机制，特别是明确了其对Leydig细胞线粒体功能与生物合成的促进作用。这不仅为ASTA作为一种绿色、天然的饲料添加剂，应用于延长种公鸡繁殖寿命、提高家禽养殖经济效益提供了扎实的理论基础，其揭示的关于通过改善线粒体健康和氧化还原态来对抗生殖衰老的机理，也为理解其他动物乃至人类与年龄相关的雄激素下降问题提供了有价值的科学参考。未来研究可进一步探索ASTA是否通过调节内质网功能等其它细胞器来协同促进类固醇合成，以更全面地描绘其作用图谱。
