《Poultry Science》：Co-immunization with two recombinant Newcastle disease viruses expressing ILTV gB and H9N2 AIV HA confers protective efficacy against three avian pathogens
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本研究针对家禽生产中新城疫、H9N2禽流感和传染性喉气管炎（ILT）多重感染严重、防控成本高昂的难题，创新性地采用热稳定新城疫病毒（TS09-C）为载体，构建并共免疫了表达H9N2病毒HA蛋白（rTS-H9）和ILTV gB蛋白（rTS-gB）的重组病毒。结果表明，联合免疫在家禽中能诱导非干扰的有效体液免疫应答，并提供针对三种病原体的全面保护，显著减轻临床症状和病毒脱落。这项工作为开发新型多联疫苗、简化家禽免疫程序提供了高效可行的方案。
在家禽密集养殖的今天，多种呼吸道病毒（如新城疫病毒、H9N2亚型禽流感病毒和传染性喉气管炎病毒）同时流行已成为一个严峻的挑战。它们不仅各自能导致严重的呼吸道疾病，还存在协同致病作用，给养殖业造成了巨大的经济损失。传统的防控策略依赖生物安全和疫苗接种，但现有疫苗各有局限：传统的灭活疫苗虽安全，但难以有效诱导黏膜免疫，且成本较高、需注射接种；而活减毒疫苗虽有较好的免疫效果，却存在毒力返强、潜伏感染和母源抗体干扰等生物安全风险。更为棘手的是，当前的商业生产需要依次接种多种不同的疫苗才能获得广谱保护，这种繁琐的免疫程序显著增加了成本。因此，开发能够一次免疫、同时预防多种疾病的新型高效疫苗，成为禽病防控领域亟待突破的瓶颈。
在这一背景下，研究人员将目光投向了以新城疫病毒（NDV）为载体的重组疫苗。NDV作为一种单股负链RNA病毒，因其良好的安全性、易于通过黏膜途径（如喷雾、饮水）大规模免疫，并能诱导全面免疫应答的优势，被视为理想的疫苗载体平台。基于这些考量，近期发表在《Poultry Science》上的一项研究，就深入探索了利用两种重组新城疫病毒进行联合免疫，以同时防控三种主要禽类病毒的可能性。
为了开展此项研究，研究人员主要采用了以下关键技术方法：首先，基于热稳定的NDV TS09-C毒株，利用反向遗传学技术构建了两种重组病毒——表达H9N2禽流感病毒HA蛋白的rTS-H9和表达传染性喉气管炎病毒gB蛋白的rTS-gB。研究分别使用无特定病原体（SPF）鸡和商业鸡（包含母源抗体）建立了动物模型。通过间接免疫荧光、蛋白质免疫印迹和病毒滴度测定评估了两种重组病毒在细胞水平共感染的相互干扰情况。通过血凝抑制试验和酶联免疫吸附试验监测免疫后鸡只的特异性抗体水平。最后，通过以H9N2 DY0602株、ILTV WG株或NDV F48E9株进行攻毒实验，系统评价了联合免疫对临床症状、组织病理学损伤、组织病毒载量以及病毒排毒的保护效力。
研究结果全面验证了联合免疫策略的有效性：
1. Coinfection with rTS-H9 and rTS-gB does not affect viral growth or protein expression in vitro
体外共感染实验证实，rTS-H9和rTS-gB在BHK-21细胞和鸡胚成纤维细胞中共同感染时，两种病毒的复制动力学以及外源蛋白（HA和gB）的表达水平，与各自单独感染组相当。蛋白质免疫印迹分析也显示，共感染细胞中HA和gB蛋白的表达量没有差异。这些结果表明，这两种重组病毒在体外没有表现出显著的相互干扰。
2. Co-immunization with rTS-H9 and rTS-gB elicits noninterfering humoral immune responses against three viral targets in SPF chickens
通过滴鼻/点眼的途径对SPF鸡进行联合免疫后，其血清中产生的针对NDV、H9N2 AIV和ILTV的特异性抗体滴度与单一病毒免疫组相当，没有统计学上的显著差异。这证明联合免疫能够在雏鸡中诱导针对三种靶标病毒的非干扰性体液免疫应答。
3. Co-immunization alleviates clinical symptoms, reduces mortality, and decreases tissue viral loads following challenge with three pathogens in SPF chickens
攻毒保护实验显示，联合免疫提供了与单苗免疫同等的保护效力。例如，在攻毒后，免疫组鸡只的临床症状更轻、死亡率更低。通过定量PCR测定，免疫鸡只在攻毒后第3天的呼吸道和消化道组织（如气管、肺、十二指肠、喉头）中的病毒载量显著低于磷酸盐缓冲盐水对照组。
4. Co-immunization reduces histopathological damage following challenge with three pathogens in SPF chickens
组织病理学分析进一步证实了疫苗的保护效果。例如，在H9N2攻毒后，免疫组鸡只保持了正常的肺泡结构和十二指肠绒毛结构，而对照组则出现了严重的间质出血和腺体坏死等病变。在ILTV和NDV攻毒后，也观察到了类似的组织保护效应。
5. Co-immunization reduces viral shedding following challenge with three pathogens in SPF chickens
病毒排毒是评价疫苗效力的关键指标。研究通过采集气管和泄殖腔拭子进行病毒检测发现，无论是哪种病毒攻毒，联合免疫组的鸡只病毒排毒率和排毒量均显著低于对照组，且排毒持续时间更短，在攻毒后第7天基本检测不到病毒，而对照组则持续排毒。
6. Co-immunization with rTS-H9 and rTS-gB confers robust immune protection in commercial chickens
为了评估联合免疫在实际养殖中的应用潜力，研究还对带有高水平母源抗体的1日龄商业鸡进行了喷雾免疫。结果显示，联合免疫能够有效克服母源抗体的干扰，诱导出有效的抗体反应。攻毒后，免疫鸡同样表现出显著减轻的临床症状、更低的组织病毒载量和病毒排毒率，其保护效果与单苗免疫组无显著差异。
综上所述，这项研究通过系统的体外和体内实验，证实了基于热稳定TS09-C株的两种重组新城疫病毒（rTS-H9和rTS-gB）进行联合免疫的可行性。该策略在细胞水平无相互干扰，在SPF鸡和商业鸡中均能诱导出强效且非干扰的体液免疫，并对NDV、H9N2 AIV和ILTV三种病原体的强毒攻击提供与单苗免疫相当的有效保护。更重要的是，这种喷雾共免疫的方式适用于存在母源抗子的商业雏鸡，且热稳定的特性使其更适应大规模养殖场的环境。这项研究成果不仅为使用NDV载体疫苗进行联合免疫提供了坚实的理论依据，也为在多种禽类病原体共存的地区，提供了一种更便捷、高效的“一针多防”免疫控制新策略，具有重要的实践意义和应用前景。
