《Separation and Purification Technology》：Downstream processing of alkaloids from whole-cell biotransformation: The application of membrane filtration and solvent extraction
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生物碱纯化技术研究中，耦合液液萃取（苯甲烷与异戊醇混合溶剂）与纳滤工艺可有效浓缩酵母发酵液中nororipavine，浓度从3.5g/L提升至32g/L，同时去除杂质。该工艺经pH调节后直接用于下游化学合成，制备3,17-二苯甲基nororipavine中间体，产率达93%，纯度92%，为工业化生产提供新思路。
Xu Li|George Q. Chen|Siyi Xue|Tim A. Bowser|Sandra E. Kentish|Sally L. Gras
澳大利亚维多利亚州帕克维尔市墨尔本大学化学工程系，邮编3010
摘要
生物碱类药物的生物合成已得到广泛研究，主要集中在提高上游生物反应器中的产量和生产效率上。然而，对于产物生物碱的回收和纯化过程的研究相对较少。本研究探讨了超滤、纳滤和液-液萃取在下游处理中的应用潜力，这些方法用于处理含有天然苯基异喹啉生物碱奥里帕芬（oripavine）及其去甲基化产物诺罗里帕芬（nororipavine）的酵母发酵液。诺罗里帕芬是一种可用于合成FDA批准药物丁丙诺啡（buprenorphine）的前体。实验表明，在60:40（体积比）的甲苯和异戊醇混合物作为萃取剂的情况下，经过液-液萃取后进行纳滤处理的效果最佳，每一步的浓缩倍数约为3倍。该工艺将诺罗里帕芬的浓度从约3.5克/升提升至32克/升，并同时去除了发酵液中的杂质。所得浓缩液直接用于下游化学反应，成功合成了丁丙诺啡的关键中间体3,17-二苯基诺罗里帕芬，产率为93%，纯度为92%。本研究为苯基异喹啉生物碱在发酵后的处理提供了有价值的见解，这对它们的工业化生产具有重要意义。
引言
苯基异喹啉生物碱（BIAs）是一大类天然化合物，由罂粟科（Papaveraceae）、毛茛科（Ranunculaceae）、小檗科（Berberidaceae）和金虎尾科（Menispermaceae）植物通过次级代谢途径产生[1]。由于具有多种药理活性（如镇痛作用[2]、抗癌作用[3]和抗糖尿病作用[4]），BIAs在制药工业中具有重要意义。天然BIAs还可作为半合成药物的前体。例如，存在于Papaver somniferum中的忒巴因（thebaine）和奥里帕芬（oripavine）可用于合成奥施康定（oxycodone）等镇痛药、纳洛酮（naloxone）和纳曲酮（naltrexone）等阿片类拮抗剂，以及丁丙诺啡（buprenorphine）[6],[7],[8],[9]。随着对BIAs及其衍生药物需求的增加，人们开始研究利用全细胞微生物转化技术在发酵液中生产这些化合物：包括合成镇痛药奥施康定、纳洛酮和纳曲酮；半合成BIAs如羟考酮（oxycodone）、氢可酮（hydromorphone）和氢可酮（hydrocodone）[11],[16]；以及用作其他BIAs和BIAs衍生药物底物的天然BIAs（如S-reticuline、忒巴因、奥里帕芬）[12],[14],[15],[16],[17]。上游的生物转化过程通常是研究的重点，研究者们致力于探索关键酶的作用机制[5],[18],[19]、酶的突变[15],[20]、常见宿主（大肠杆菌（E. coli）和酿酒酵母（S. cerevisiae）的微生物工厂设计[14],[15],[22],[23]，以及发酵条件的优化[13],[14]。相比之下，下游的处理步骤（如BIAs及其衍生物的提取和纯化）则较少受到关注。目前，专利文献中仅提出了从发酵液中提取BIAs的潜在方法[24],[25]，但缺乏对其提取效率的系统性评估。然而，开发经济高效且可持续的提取工艺至关重要，因为生物制药的生产成本通常主要由下游处理环节决定[27]。液-液萃取（LLE，也称为溶剂萃取）是一种经典且常用的分离技术，广泛用于提取植物中的活性化合物（如生物碱[28]）以及回收和纯化大分子生物制品（如重组蛋白[30]）。LLE通常包括一个前向萃取步骤，将目标化合物从进料溶液转移到有机溶剂（萃取剂）中；随后可能通过一个反向萃取步骤将化合物转移到新的水相中，以提高萃取选择性或纯度[31],[32]。常用的新水相为酸性或碱性溶液，可以改变目标化合物的溶解度或电荷状态。例如，氢氧化钠溶液和碳酸钠溶液常用于羧酸和戊酸的反向萃取[31],[32]。我们研究中采用的反向萃取方法会产生强碱性溶液，这对后续的浓缩步骤（如膜过滤）带来挑战。纳滤（NF）是一种压力驱动的膜分离技术，基于分子的大小（通过空间排阻作用）和电荷（通过Donnan排斥和介电排斥作用）进行分离[33]。该技术已在制药工业中用于分离氨基酸、内分泌干扰化合物和生物制药化合物[34],[35]。大于150 Da的非带电有机化合物可被纳滤膜有效截留[36]，因此纳滤是浓缩生物转化产物（如299 Da的丁丙诺啡）和BIAs衍生物（如本研究中283 Da的诺罗里帕芬）的有效方法。市场上主流的纳滤膜使用聚酰胺作为活性层，但在高碱性条件下其化学稳定性较差，仅能短期耐受pH值超过11的环境[37]。因此，在这些应用中需要使用耐碱性的纳滤膜[38]。据我们所知，尚未研究耐碱纳滤膜在生物碱提取和浓缩中的可行性。此外，研究LLE与膜过滤结合的最佳策略对于提高BIAs的回收率和纯度至关重要，这有助于选择最适合工业生产的分离和纯化技术。
在本研究中，我们考察了五种可用于从发酵液中浓缩诺罗里帕芬的下游工艺（方案1）。这些工艺利用工程化酵母通过N-去甲基化反应将奥里帕芬转化为诺罗里帕芬（方案2，步骤1）。这是合成重要半合成阿片类药物（如丁丙诺啡和纳洛酮）的关键步骤[39]。这些工艺可单独或联合使用LLE和纳滤。其中一种工艺还结合了超滤（UF）作为预处理步骤，以澄清发酵液后再进行纳滤。通过系统地调整pH值来提高生物碱的溶解度，最终获得了杂质更少的浓缩诺罗里帕芬溶液。最后通过苄基化反应生成了稳定的诺罗里帕芬衍生物3,17-二苯基诺罗里帕芬（方案2，步骤2）。这种苄基化处理有助于提高诺罗里帕芬的储存稳定性，并选择性地去除下游处理后残留的奥里帕芬。
材料
发酵液是在实验室规模的生物反应器中通过先前专利[24]中详细描述过的生物转化工艺制备的，并最近进行了进一步表征[40]。简要来说，将经过基因改造的S. cerevisiae菌株以分批补料模式培养，并通过全细胞N-去甲基化反应将奥里帕芬转化为诺罗里帕芬。来自该生物转化过程的几批发酵液均经过了预处理
液-液萃取作为独立的下游处理方法——过程1
首先单独探讨了液-液萃取（LLE）作为从发酵液中回收诺罗里帕芬的方法（过程1，方案1）。首先测试了纯甲苯作为前向萃取的有机相，因为这种溶剂在药物生产中常用[28]，包括从鸦片中提取生物碱[43]。然而，甲苯作为萃取剂时未能实现较高的诺罗里帕芬提取效率，因此优化了甲苯和异戊醇的混合溶剂组合
结论
研究了纳滤、超滤和液-液萃取在生物转化产物中回收诺罗里帕芬的效果。液-液萃取为从复杂发酵液中选择性回收诺罗里帕芬提供了有效途径，理想情况下后续应采用纳滤进行浓缩。当结合pH值调节的发酵液时，这种两步法效果最佳，既能保证较高的通量，又能有效浓缩产物
CRediT作者贡献声明
Xu Li：撰写初稿、验证、方法学设计、实验设计、数据分析、概念构建。George Q. Chen：撰写初稿、验证、方法学设计、实验设计、数据分析、概念构建。Siyi Xue：数据管理、审稿与编辑。Tim A. Bowser：概念构建、方法学设计、撰写与审稿、资金筹集、资源协调。Sandra E. Kentish：概念构建、方法学设计、实验指导、撰写与审稿
利益冲突声明
作者声明以下可能构成潜在利益冲突的财务关系/个人关系：Sally Gras表示获得了River Stone Biotech ApS的财务支持；Sally Gras还表示获得了River Stone Biotech Australia Pty Ltd的财务支持。其他作者声明不存在可能影响本文研究的财务关系或个人利益。
致谢
本研究得到了River Stone Biotech Aps（丹麦）和River Stone Biotech Australia的支持。感谢墨尔本大学生物21研究所（Bio21 Institute）的Daniel Yaw在分子溶解度预测方面的帮助，以及墨尔本大学生物21质谱与蛋白质组学设施（Bio21 Melbourne Mass Spectrometry and Proteomics Facility）的技术支持。
