L-酪氨酸稳定的银纳米颗粒用于过氧化氢的比色检测

《Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy》：L-tyrosine stabilized silver nanoparticles for colorimetric detection of hydrogen peroxide

基于酪氨酸稳定银纳米颗粒的颜色指标法检测过氧化氢的研究，在水和血清中均表现出良好线性范围（0.4-5 μM和0.7-20 μM）及较低检测限（150-250 nM），回收率96-101%验证可靠性，通过荧光光谱和DLS分析纳米颗粒与H?O?的相互作用机制。

　　

Nikolai V. Shekhovtsov | Tomash S. Sych | Andrey A. Buglak | Alexei I. Kononov

圣彼得堡国立大学，Universitetskaya Embankment 7-9号，199034，圣彼得堡，俄罗斯

摘要

过氧化氢（H₂O₂）是一种在生物组织中广泛存在的活性氧物种。它是氧化应激、癌症、哮喘等的重要生物标志物。因此，开发精确且成本低廉的传感器以在体外和体内检测H₂O₂对生物医学具有重要意义。本文介绍了一种使用酪氨酸稳定的银纳米颗粒检测过氧化氢的比色法。在水溶液中，该比色法的线性范围为0.4–5 μM，检测限（LOD）为150 nM；而在人血清中，线性范围为0.7–20 μM，检测限为250 nM。血清中的回收测试结果在96–101%的范围内，证实了该方法的准确性和可靠性。通过荧光光谱和动态光散射方法研究了银纳米颗粒/纳米团簇与H₂O₂相互作用的可能机制。

引言

过氧化氢（H₂O₂）属于活性氧（ROS）的一种，与超氧阴离子自由基（O₂^•-）、羟基自由基（OH^•）、单线态氧（¹O₂）等一起发挥作用。这些短寿命的活性氧在生物体的生化过程中起着重要作用。先前研究表明，过氧化氢在细胞内部具有信号传导功能。在低浓度下，它参与各种生物过程（如细胞生长、分化和凋亡）[1]、[2]、[3]中的氧化反应。过氧化氢还增强了免疫系统对外部刺激的反应能力[3]、[4]。此外，它可以是细胞代谢的副产物[5]。某些酶可以将氧化自由基转化为过氧化氢，后者对细胞的危害较小，并可被其他酶转化为非活性物质[6]。然而，过氧化氢的过量积累也会导致细胞损伤，从而引发氧化应激——即活性氧（尤其是过氧化氢）的产生与细胞清除其多余能力之间的不平衡[6]。氧化应激会损害细胞（及其结构），改变DNA并干扰蛋白质的功能。它还会加速衰老过程，引发心血管疾病、神经退行性疾病和炎症综合征。在某些情况下，氧化应激可诱发糖尿病的发展并导致癌症突变。不过，氧化应激并不会立即引发严重疾病，最初通常表现为慢性疲劳、认知障碍以及易感染和频繁发炎等非特异性症状[1]、[4]。后期可能出现视力下降、皮肤质量下降、睡眠障碍和频繁偏头痛等症状。因此，检测包括过氧化氢在内的各种氧化应激标志物在这些综合征的诊断中仍是一项重要任务。

细胞内的过氧化氢浓度很大程度上取决于细胞类型，并可能随时间变化。多项研究表明，其正常浓度在纳摩尔范围内：1–700 nM [7] 或 1–10 nM [8]。检测细胞内过氧化氢的方法包括基因编码的生物传感器[9]、[10]、荧光传感器[11]、[12]以及其他多种方法[13]。然而，如此低的浓度难以检测，且传感器在细胞内的工作需要额外的适应性调整。因此，含有较高浓度且易于获取的过氧化氢的样本可能成为检测氧化应激的更好目标。

例如，健康人血清中的过氧化氢浓度明显较高，约为1–5 μM [14]。这一事实加上探针的相对易获得性，使得在血清中检测过氧化氢成为更具吸引力的选择。此前已有许多技术用于检测水和各种生物流体中的过氧化氢，包括各种电化学方法（最近的综述可参考其他文献[15]）、化学发光方法[16]、[17]以及比色[18]、[19]、[20]、[21]和荧光[22]、[23]、[24]、[25]传感器。虽然电化学方法通常最精确，但耗时且劳动强度大。光谱方法虽然简单得多，但灵敏度通常较低，或者需要额外的氧化剂（如葡萄糖氧化酶或谷胱甘肽[17]、[19]），这进一步增加了系统的复杂性。在所有情况下，这些传感系统在实际样本（如生物流体）中的应用都容易受到干扰，导致低浓度和/或线性范围内的灵敏度不足。因此，一种廉价、简单且能够在实际样本中检测过氧化氢的传感系统仍然非常需要。

金属纳米颗粒（NPs）是由无机金属（如银、铜、金、锌）或金属氧化物组成的亚微米级结构。由于其较大的表面积与体积比，这些颗粒具有独特的光学和电磁特性[26]。这些特性使金属纳米颗粒可用于抗菌剂[27]、催化剂[28]、[29]和生物传感器[30]、[31]。后者功能中，金和银纳米颗粒因其强烈的催化活性和吸收光谱中的表面等离子体共振（SPR）峰而被用作电化学比色传感器的组成部分。最近，基于金属纳米颗粒的比色传感器已被用于检测各种小分子、金属离子和其他化合物[32]、[33]、[34]、[35]，包括活性氧物种。

特别是，金属纳米颗粒已被有效用于在各种介质中检测H₂O₂。例如，可以使用淀粉模板化的银纳米颗粒[36]、姜黄素功能化的金纳米颗粒[37]、用Benincasa hispida提取物合成的生物源Ag纳米颗粒[38]以及用Dalbergia sissoo锯末沉积的镍纳米颗粒[39]检测尿液中的过氧化氢纳米摩尔浓度。使用金属纳米颗粒检测H₂O₂的相关研究已在近期综述中总结[40]、[41]。

在本研究中，使用L-酪氨酸修饰的银纳米颗粒（Tyr-Ag NPs）来检测过氧化氢，既在水溶液中也在血清中进行。通过UV–vis光谱、发光光谱和动态光散射（DLS）研究了Tyr-Ag NPs的作用机制。总体而言，本研究提出了一种简单且成本低廉的方法，能够有效检测0–20 μM范围内的血清中的H₂O₂。

化学试剂

L-酪氨酸（目录编号#93829）、氢氧化钠（NaOH）（目录编号#655104）、硼氢化钠（NaBH₄）（目录编号#71320）和硝酸银（AgNO₃）（目录编号#1.01510）均从Sigma-Aldrich购买。过氧化氢储备溶液（35%）由‘Reahim’（俄罗斯）制备。在人血清测试中使用了Capricorn Scientific公司的人血清（AB型）。

Tyr稳定银纳米颗粒的合成

按照先前报道的方法进行了典型的合成过程，并进行了一些重要的修改[42]。首先，准备1 mL的水溶液...

所得系统的表征

图1显示了新制备的Tyr-Ag NPs溶液的光谱和粒径分布。光谱中的光密度具有明显的表面等离子体共振（SPR）峰，最大值约为410 nm，这适用于半径约为25–30 nm的球形银纳米颗粒[47]。DLS测得的粒径分布表明存在两种不同大小的纳米颗粒，这是由于强度自相关函数中存在两种模式所致...

结论

根据实验结果，Tyr-Ag NPs在复杂的生物环境中（如人血清）作为过氧化氢传感器显示出显著潜力。尽管与血清蛋白的相互作用和H₂O₂诱导的分解过程会影响纳米颗粒的稳定性和光学性质，但系统地平衡实验条件并校正时间依赖性的活性损失，可以实现对H₂O₂的可靠定量。观察到的荧光和光学变化...

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

本研究由俄罗斯科学基金会资助，项目编号为20-73-10029（https://rscf.ru/en/project/20-73-10029/#!/）。DLS测量使用了圣彼得堡国立大学功能材料医学、药理学和纳米电子学诊断中心的设备。Zeta电位测量使用了圣彼得堡国立大学光学和激光材料研究中心的设备。