《Theriogenology》：Effect of glycine on the subsequent embryonic developmental competence of vitrified porcine parthenogenetically activated embryos
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甘氨酸通过减轻氧化应激、抑制凋亡及保护线粒体功能增强猪胚胎冷冻后发育潜力，6 mM甘氨酸效果最佳。
作者：翟登荣、吴云苏、李炯奎、蔡玉池、于凯月、肖吉轩、刘益轩、王家格、刘海星、李晓霞
中国延边大学农学院，延吉133000
摘要
胚胎冷冻保存会引发氧化应激，这是影响胚胎发育能力的关键因素。甘氨酸（Gly）是一种有机渗透调节剂，可以调节细胞体积并作为谷胱甘肽（GSH）的组成部分，通过清除活性氧（ROS）和抑制细胞凋亡来保护细胞免受氧化应激的损害，从而提高卵子的冷冻保存效率。本研究以猪孤雌激活（PA）1细胞胚胎为模型，探讨了甘氨酸在提高玻璃化-解冻后猪胚胎发育潜力方面的作用，并阐明了其在玻璃化和解冻过程中的细胞保护机制。猪PA 1细胞胚胎在玻璃化和解冻溶液中分别添加了0、3、6或9 mM的甘氨酸；结果表明，添加6 mM甘氨酸时，胚胎的裂变率和囊胚率最高。经甘氨酸处理的PA 1细胞胚胎表现出较低的ROS产生量和较高的GSH水平。玻璃化处理会增加溶酶体的荧光强度，降低线粒体膜电位（MMP）和ATP含量，而甘氨酸处理可以逆转这些效应；此外，caspase-3活性未受影响。与未添加甘氨酸的对照组相比，甘氨酸上调了与抗氧化防御、抗凋亡、溶酶体功能、自噬和多能性相关的mRNA表达基因。总之，甘氨酸通过缓解玻璃化和解冻过程中产生的渗透压和氧化应激，增强了猪胚胎的发育能力，为优化冷冻保存方案提供了策略。
引言
猪胚胎的冷冻保存有助于利用宝贵的遗传资源，是保存来自基因工程和克隆等体外技术的胚胎的有效方法，从而推动生物技术和生物医学的发展[1]。目前，玻璃化是保存不同发育阶段猪胚胎最常用且最有效的方法[2][3]。受精卵代表了胚胎发育的最早全能阶段，保留了分化为所有细胞类型并形成完整生物体的全部遗传潜力[4]。与后期胚胎（如4细胞或8细胞阶段）不同，受精卵的细胞成分相对均匀，代谢网络简单[5][6][7][8]。这种结构和功能的简单性使得孤雌激活（PA）1细胞胚胎成为研究玻璃化过程中的冷冻损伤和冷冻保护的理想模型，因为它们对玻璃化/解冻应激的反应不受到特定细胞复杂性的影响。然而，关于早期猪胚胎冷冻保存的研究相对较少。有报道称，未经预处理的体内来源的猪受精卵玻璃化后有超过40%能够发育成囊胚[9]。因此，减少PA 1细胞胚胎在冷冻过程中的氧化损伤可以显著提高囊胚形成的率和质量。许多研究表明，冷冻保存会导致卵子和胚胎中ROS过量产生，从而增加氧化应激，这可能是导致其质量和发育受损的原因[10]。过量的ROS最终会导致生理、生化和分子层面的变化，包括DNA片段化、纺锤体缺陷、代谢异常、细胞器功能障碍和细胞凋亡[11][12]。ROS的产生增加也是导致卵子冷冻后存活率下降的关键因素[13]。此外，多种抗氧化剂可以有效抑制冷冻保存过程中卵子和胚胎的氧化应激。常用的抗氧化剂如褪黑素[14][15]、白藜芦醇[16][17]、L-肉碱[18][19]和谷胱甘肽[20][21]已被证明可以提高冷冻保存后的卵子和胚胎的潜力。
甘氨酸具有抗氧化、抗炎和细胞保护作用[22][23]。它可以防止有害因素（包括氧化应激和渗透压损伤）在细胞、器官和生物体层面引起的卵子和胚胎发育障碍，在生殖系统中发挥重要作用。研究表明，在玻璃化溶液中添加甘氨酸可以改善卵子的线粒体功能，减少细胞凋亡，并提高后续的发育潜力[24][25]。例如，小鼠完全成熟的生殖泡（GV）卵子通过GLYT1转运蛋白积累甘氨酸来调节细胞体积[26]。先前的研究还表明，甘氨酸补充可以缓解玻璃化/解冻引起的渗透压应激，通过降低ROS水平、增强线粒体功能和减少细胞凋亡来改善玻璃化小鼠卵子的发育[25]，从而提高猪卵子的体外成熟率和胚胎发育率[27][28]。尽管甘氨酸对卵子成熟和胚胎发育有这些有益作用，但尚不清楚它是否可以通过其抗氧化能力保护冷冻后的猪PA 1细胞胚胎。基于以上问题，本研究的目的是了解甘氨酸如何提高玻璃化猪1细胞胚胎的发育潜力，并确认甘氨酸在玻璃化和解冻过程中对猪PA 1细胞胚胎的细胞保护作用。
实验细节
动物
本实验使用的猪卵巢来自当地屠宰场（中国吉林万新肉制品有限公司）。所有动物实验均获得了吉林农业科学技术学院机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准，研究方案编号为LLSC202402033。
化学试剂
本研究中使用的所有化学试剂均来自Sigma-Aldrich Chemical Company，除非另有特别说明。
实验设计
本研究……
甘氨酸补充对PA 1细胞胚胎发育能力的影响
首先，为了评估甘氨酸补充对玻璃化1细胞胚胎发育能力的潜在影响，将胚胎培养在含有玻璃化溶液和解冻溶液的培养基中，并添加不同浓度的甘氨酸（0、3、6和9 mM）。如表2和图1A所示，Vitr + 6 mM Gly组和Fresh组的裂变率（分别为77.51 ± 1.70%和82.02 ± 1.82%）没有差异（P > 0.05），并且显著高于……（P < 0.05）
讨论
由于甘氨酸的抗氧化特性，它在生殖生物学领域受到了越来越多的关注。本研究阐明了甘氨酸对猪胚胎冷冻保存的影响及其作用机制，证明了在玻璃化和解冻过程中添加甘氨酸可以提高猪胚胎的质量和发育能力。据我们所知，这是首次报道甘氨酸在猪PA 1细胞胚胎冷冻保存中的应用，具有重要的意义。
结论
总之，我们的研究结果表明，在玻璃化和解冻过程中添加6 mM的甘氨酸可以显著提高孤雌激活猪胚胎的质量及其后续的发育能力。此外，甘氨酸的有益效果可能与特定的保护机制有关，包括缓解氧化应激、恢复溶酶体功能、增强线粒体功能以及改变重要基因的mRNA表达。
作者贡献声明
蔡玉池：方法学。
于凯月：软件。
李炯奎：软件。
王家格：方法学。
刘海星：写作——审稿与编辑、监督、资源协调、研究设计、概念构思。
肖吉轩：软件。
刘益轩：数据分析。
翟登荣：写作——初稿撰写、软件应用、方法学设计、研究实施、数据分析、概念构思。
吴云苏：软件应用、数据分析。
李晓霞：写作——审稿与编辑、监督、资源协调、项目管理。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或其他个人利益冲突，这些利益可能会影响本文的研究结果。
资助
本工作得到了吉林省科学技术发展计划（20230101264JC）的资助。
利益冲突声明
我们声明与任何可能不恰当地影响我们工作的个人或组织没有财务和个人关系，对任何产品、服务或公司没有专业或其他个人利益，这些利益可能会影响本文的观点或手稿“甘氨酸对玻璃化孤雌激活胚胎后续发育能力的影响”的评审。
