《Trees, Forests and People》：Genetic characterization of the male-sterile Japanese cedar ‘Fukushima-funen 3’ reveals a naturally pyramided genotype and a novel
MS2 allele, and leads to the development of marker-assisted selection for the
MS2 locus
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为应对日本柳杉花粉引发的日益严重的公众健康问题（过敏），本研究聚焦于雄性不育植株的应用潜力。研究人员对雄性不育柳杉品种‘福岛-funen 3’进行了深入的遗传解析，鉴定出其雄性不育由MS2基因控制，并发现了一个新的8-bp缺失型等位基因ms2-2，同时揭示该个体在MS1位点呈杂合状态，形成一个罕见的自然基因堆叠。基于此开发出针对MS2位点的DNA标记，通过筛选1,511份育种材料，成功鉴定出携带ms2等位基因的个体。这些发现不仅深化了对柳杉雄性不育遗传机制的理解，也为通过标记辅助选择(MAS)高效培育多基因叠加的低花粉树种提供了新策略，对减轻花粉过敏的公共卫生负担具有重要意义。
每到春季，在日本街头巷尾，许多人都会饱受花粉过敏之苦。这其中，作为日本重要造林树种和主要过敏原来源的日本柳杉（Cryptomeria japonica）功不可没。据统计，2019年日本人口中约有38.3%受到其花粉困扰。为了从源头上减少这种“绿色烦恼”，科学家们将目光投向了雄性不育的柳杉——它们不会产生和散播致敏花粉。然而，雄性不育个体在自然界中极为罕见，仅约数千株中才有一株，且其不育性的遗传基础需要逐一鉴定，这为高效、定向培育低花粉柳杉品种带来了巨大挑战。正是在这样的背景下，一项针对一个名为‘福岛-funen 3’的雄性不育个体的深入研究，为我们揭示了柳杉不育遗传的“密码”，并开辟了加速育种进程的新途径。
这项发表于《Trees, Forests and People》的研究，综合运用了遗传杂交（测交）、显微观察和分子生物学手段。研究人员首先通过人工授粉，将‘福岛-funen 3’与已知雄性不育基因（MS1–MS5）的杂合子个体进行杂交，并观察其后代的育性分离情况。同时，通过石蜡切片和显微技术，详细观察了‘福岛-funen 3’花粉发育过程的异常表现。在分子层面，研究利用片段分析和桑格(Sanger)测序技术对目标基因进行基因分型和序列分析。特别值得一提的是，为了精准解析‘福岛-funen 3’在MS2候选基因上的等位基因型，研究者创新性地使用了从种子中分离出的单倍体雌配子体DNA进行测序，从而避免了二倍体基因组中两条染色体序列的干扰。为了在大规模群体中高效筛选目标基因型，研究者开发并验证了基于竞争性等位基因特异性PCR(Kompetitive Allele-Specific PCR, KASP)和扩增长度多态性(Amplified Length Polymorphism, ALP)的DNA标记。研究分析的1,511份育种材料广泛采集自日本20个都道府县，构成了一个地理来源广泛的样本队列，用于评估所开发标记的应用效果和寻找新的不育基因携带者。
3.1.1. 测交
通过对‘福岛-funen 3’与已知雄性不育基因杂合个体杂交的后代进行育性分析，研究人员发现：当其与MS2杂合体杂交时，后代可育与不育个体的分离比符合1:1的理论值，这表明‘福岛-funen 3’的雄性不育由MS2基因控制。而与其他已知不育基因（MS1, MS3, MS4, MS5）杂合体杂交的后代，其分离比均不符合1:1，其中与MS1杂合体杂交的后代分离比符合3:1，这强烈暗示‘福岛-funen 3’在MS1位点本身也是杂合子（携带一个不育等位基因）。
3.1.2. ‘福岛-funen 3’花粉发育异常观察
通过显微镜观察花粉发育过程，研究人员发现‘福岛-funen 3’与已知的MS2不育突变体‘信岱1号’表现出相同的异常表型：从四分体期开始，小孢子囊内密度异常增高；在早期单核小孢子期，小孢子发生粘连；随后，小孢子囊从晚期单核小孢子期开始萎缩。这些特征与MS2诱导的雄性不育典型表型完全一致，从表型上进一步证实了MS2是导致其不育的原因。
3.2.2. 利用雌配子体DNA对MS2位点进行桑格测序
通过对雌配子体DNA的测序，研究人员在‘福岛-funen 3’的MS2候选基因GELP（GDSL型酯酶/脂肪酶蛋白基因）中鉴定出两种不同的突变等位基因。其中一个是此前已报道的单核苷酸多态性(Single-Nucleotide Polymorphism, SNP) c.119C>T（导致p.S40F氨基酸替换），被命名为ms2-1。另一个是本研究新发现的8个碱基对的缺失（c.116_123delATTCTCTG），被命名为ms2-2。该缺失导致了移码突变，并在第44位氨基酸处提前引入了一个终止密码子(p.A44*)。这表明‘福岛-funen 3’在MS2位点是ms2-1/ms2-2的复合杂合子。
3.4. 对携带ms2-1或ms2-2等位基因个体的标记辅助选择
利用开发的KASP标记（针对ms2-1）和ALP标记（针对ms2-2），研究人员对来自日本20个都道府县的1,511份育种材料进行了大规模筛选。结果成功鉴定出8份携带ms2等位基因的材料。值得注意的是，其中一些个体，如‘福岛-funen 3’本身和‘信岱11号’等，除了携带ms2等位基因外，还被发现同时携带ms1等位基因，即存在多个雄性不育位点的自然堆叠现象。为了降低成本，研究者还测试并验证了使用8个个体混合的DNA样本进行ALP标记分析来筛选ms2-2的可行性。
本研究系统性地解析了雄性不育柳杉‘福岛-funen 3’的遗传基础，得出核心结论：第一，其不育性状由MS2基因控制，并在该位点携带一个新的8-bp缺失型等位基因ms2-2，与已知的SNP型等位基因ms2-1构成复合杂合。第二，该个体在MS1位点呈杂合状态（Ms1/ms1-1），是一个罕见的、通过自然突变形成的双不育基因（MS1和MS2）叠加个体。第三，成功开发出用于检测ms2-1和ms2-2等位基因的分子标记，并证明其在大量育种材料中进行标记辅助选择(Marker-Assisted Selection, MAS)的有效性，筛选出了可用于育种的新材料。
讨论部分进一步强调了这些发现的重要意义。首先，在‘福岛-funen 3’中鉴定到的GELP基因新突变（ms2-2）为证实该基因是MS2的因果基因提供了更坚实的遗传证据。其次，携带多个不育等位基因（如ms1和ms2）的个体（如‘福岛-funen 3’、‘信岱11号’、‘柏崎市1号’和‘热海1号’）的发现，为实施基因叠加(Gene Pyramiding)育种策略提供了宝贵的亲本材料。理论上，利用双纯合不育个体与双杂合个体杂交，可将雄性不育后代的比例从目前的50%提升至75%，显著提高低花粉树种苗木的生产效率。最后，本研究所建立的分子标记筛选体系，为克服某些不育类型（如MS2型）因花粉发育异常不完全而难以通过传统肉眼观察法准确筛选的难题提供了高效、可靠的解决方案。
综上所述，这项研究不仅深化了对日本柳杉雄性不育分子机制的理解，更重要的是，它通过鉴定新等位基因、开发实用分子标记以及发现可用于基因叠加育种的珍贵材料，为加速培育具有多重雄性不育基因的、低花粉排放的柳杉新品种奠定了坚实的技术基础，对从源头控制花粉扩散、减轻公众健康负担具有重要的实际应用价值。
