胆固醇竞争性抑制辣椒素激活TRPV1离子通道

《Channels》：Cholesterol inhibits capsaicin activation of the TRPV1 channel

本文综述了胆固醇在香草素结合口袋通过竞争性抑制辣椒素激活TRPV1离子通道的新机制，强调了脂质调控在痛觉信号转导中的关键作用，为基于膜脂质环境的疼痛治疗策略提供了新视角。

　　

引言

TRPV1（瞬时受体电位香草素亚型1）通道主要在外周伤害性感觉神经元中表达，介导热感知和疼痛信号传导，同时也存在于一些中枢和非神经元组织中。尽管脂质对TRPV1活性的调控已有较多报道，但其潜在机制尚未完全阐明。最近，人源TRPV1与强效、选择性、非竞争性拮抗剂SAF312复合物的冷冻电镜结构，为理解其抑制机制以及胆固醇对TRPV1活性的调控提供了结构洞察。SAF312占据了香草素结合口袋，从而阻止了TRPV1通道门控所必需的S4和S5螺旋的构象重排。出乎意料的是，观察到一个假定的胆固醇分子参与了SAF312介导的抑制。

为了进一步探索TRPV1与胆固醇相互作用的功能意义，研究者进行了分子对接分析结合功能实验。对接算法生成了多种蛋白质-配体构象，并根据能量稳定性进行排序，其中最有利的构象代表了最可能的结合模式。对10个最低能量构象的分析揭示了胆固醇的两个主要结合区域：一个位于S1和S2片段之间的蛋白质-膜界面，另一个位于一个亚基的S5-S6区域与相邻亚基的S4螺旋及S4-S5接头之间。后一个位点位于蛋白质内部更深的位置，与膜的接触最少。冷冻电镜也鉴定出类似的胆固醇结合口袋，该区域与香草素结合口袋位置相同。值得注意的是，预测的胆固醇在该区域的结合与预测的辣椒素（辣椒中的辛辣成分）结合位点存在重叠。这种胆固醇和香草素类分子在香草素结合口袋内共定位的预测，与观察到的胆固醇抑制辣椒素诱发的TRPV1激活现象一致。

分子模拟实验表明，施加的辣椒素在细胞膜中的分布并不均匀，其最高浓度位于脂质-水界面区域。Goswami及其同事的研究证明了胆固醇在TRPV1分子功能中的重要性，他们揭示了胆固醇与位于胞质侧脂质-水界面的关键精氨酸（Arg）残基之间的相互作用，对于TRPV1的稳定以及通道功能所需的构象动力学至关重要。基于大鼠TRPV1的高分辨率冷冻电镜结构、脂质-水界面区域氨基酸保守性分析以及所选氨基酸的物理化学行为，他们发现将Arg575替换为天冬氨酸（R575D突变）会导致表达的TRPV1具有组成型活性并引起细胞死亡，而这一现象可以通过螯合细胞外Ca²⁺或降低膜胆固醇水平来挽救。值得注意的是，Arg575定位于S4-S5接头，该区域构成了香草素结合口袋的一个完整且重要的部分。在本研究中，研究者直接测试了胆固醇是否在香草素结合口袋与辣椒素竞争，从而抑制TRPV1通道的激活。

材料与方法

亚克隆与诱变

将大鼠TRPV1^WT-mcherry亚克隆到pcDNA?4/TO哺乳动物表达载体中。使用带有期望突变和5‘磷酸化修饰的引物进行PCR，完成定点诱变。PCR产物从琼脂糖凝胶中回收、纯化，并使用T4连接酶试剂盒连接，随后转化入DH5α感受态细胞。通过测序确认突变插入。

细胞培养与转染

T-REx?-293细胞在37°C下，于添加了10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素、2 mM L-谷氨酰胺、5 μg/mL Blasticidin的DMEM培养基中培养。转染前两天，将细胞铺在聚-D-赖氨酸包被的16 mm玻璃盖玻片上。次日，用1 μg pCDNA4-rTRPV1^wt-mcherry或pCDNA4-rTRPV1^G563S-mcherry质粒，连同1 μg pCDNA4-GFP质粒共转染细胞。转染使用TransIT-LT1转染试剂，按照制造商说明和协议进行。用四环素诱导质粒表达。

增加质膜胆固醇水平

调节膜胆固醇水平的常用方法涉及使用甲基-β-环糊精（MβCD），这是一种对胆固醇具有高亲和力的七葡萄糖单元环状寡聚物。其空载形式用于从膜中移除胆固醇；其胆固醇负载形式则用于富集膜胆固醇。

对于质膜胆固醇富集，使用按先前描述方法制备的MβCD:胆固醇复合物。简言之，制备100 mL 5 mM MβCD:胆固醇，将溶解在氯仿:甲醇中的胆固醇溶液转移至洁净玻璃管中蒸发。将MβCD溶解于细胞外液中，然后加入含干燥胆固醇的试管，涡旋直至所有干燥胆固醇从玻璃壁脱离，再超声处理，并于37°C加热摇床中孵育过夜。次日过滤，室温储存不超过6天。

电生理学

全细胞记录使用电阻为2-4 MΩ的硼硅酸盐记录电极。电流经5 kHz低通滤波，以10 kHz采样。施加电压斜坡协议。细胞外液包含多种离子成分，电极内液包含多种离子成分和能量物质。电流使用膜片钳放大器记录，并通过接口板数字化。

在全细胞膜片钳实验中，于瞬时表达rTRPV1^wt的T-REx?-293细胞中进行，在实验前短时间诱导表达以确保低表达水平，旨在防止rTRPV1^wt组成型电流。在建立全细胞构型并让基础电流稳定后，实验方案以应用辣椒素诱发TRPV1电流开始，随后用细胞外溶液彻底冲洗。然后用MβCD:胆固醇溶液灌流细胞，接着进行10分钟的孵育期，期间持续灌流MβCD:胆固醇。孵育结束后，彻底洗掉MβCD:胆固醇，最后再次应用相同浓度的辣椒素。在一组实验中，辣椒素浓度为1 μM；在另一组实验中，浓度为10 nM。

胆固醇富集对辣椒素诱导电流的影响分析如下：每次实验中，通过从第一次辣椒素应用诱导的最大电流中减去基础电流来计算I_max。类似地，通过从第二次辣椒素应用诱导的最大电流中减去胆固醇洗脱后的电流水平来获得I值。I/I_max比值代表了胆固醇孵育后辣椒素诱导电流的相对变化。柱状图表示平均值±标准误，统计学显著性使用配对双尾Student t检验确定。

另一组全细胞实验在瞬时表达rTRPV1^G563S的T-REx?-293细胞中进行。用辣椒素诱发电流后，彻底冲洗。随后应用MβCD:胆固醇溶液。对于rTRPV1^G563S实验的统计分析，I_max定义为每次实验中辣椒素应用诱发的峰值电流，而不减去基础电流，因为在几次实验中基础电流占据了I_max的很大一部分。测量洗脱结束和胆固醇孵育后的电流水平，并归一化到I_max。因此，I/I_max比值分别代表了洗脱或胆固醇富集后rTRPV1^G563S辣椒素诱导电流的相对变化。柱状图表示标准误，统计学显著性使用配对双尾Student t检验确定。

对接分析

对接分析在大鼠TRPV1的整个跨膜区域上进行。预测的胆固醇-rTPRV1构象进行叠加，如果它们的均方根偏差小于一定值则进行聚类。然而，由于构象间胆固醇尾部取向的细微差异，聚类标准随后被调整。每个聚类根据其结合能排序，分析前10个聚类以识别距离胆固醇分子一定范围内的相互作用残基。

结果与讨论

膜胆固醇已知通过直接与通道蛋白相互作用或间接改变它们与其他调控组分的关联，来调控众多离子通道的活性。在大多数情况下，胆固醇结合会抑制通道活性，并且在几个离子通道中已经鉴定出假定的胆固醇结合位点，通常位于跨膜螺旋之间的非环形疏水口袋中。基于大鼠TRPV1冷冻电镜结构的对接分析揭示了一个假定的胆固醇结合口袋。与香草素类分子在该区域附近的结合一致，预测胆固醇与辣椒素分子的结合存在部分重叠。因此，研究者假设胆固醇和辣椒素分子在香草素结合口袋内的共定位可能导致胆固醇抑制辣椒素对TRPV1通道的激活。

为检验这一假设，研究了膜胆固醇富集对表达该通道的T-REx?-293细胞中辣椒素诱导的TRPV1活性的影响。未检验胆固醇螯合的效果，因为这在HEK细胞中对辣椒素诱导的TRPV1电流没有影响。使用胆固醇负载的MβCD来增加膜胆固醇水平。MβCD是一种环状寡糖，具有亲水外表和疏水中心空腔，能以高亲和力结合胆固醇。在其胆固醇负载形式下，MβCD能有效地将胆固醇递送到质膜，同时可以通过冲洗迅速移除。据报道MβCD能直接螯合辣椒素。因此，在功能实验中不应同时应用MβCD和辣椒素。在本实验中，研究者彻底冲洗了含MβCD的溶液，从而防止了辣椒素和MβCD的共同应用。

为了直接检验胆固醇富集对辣椒素诱导的TRPV1功能的影响，在瞬时表达rTRPV1的T-REx?-293细胞上进行了全细胞实验，使用电压斜坡协议。用MβCD:胆固醇孵育10分钟显著降低了辣椒素诱导的TRPV1电流，但仅在使用低浓度辣椒素时如此。当应用接近饱和的、浓度高100倍的辣椒素时，未观察到电流幅度的显著降低。每次实验中，首先应用辣椒素以建立基线反应，然后在应用MβCD:胆固醇之前进行浴槽冲洗。用MβCD:胆固醇灌流维持10分钟，这个时间足以使膜胆固醇水平增加至少一定百分比。孵育期结束后，彻底洗掉MβCD:胆固醇溶液以去除任何残留的MβCD，然后重新应用相同浓度的辣椒素。在10 nM辣椒素条件下，第二次反应明显小于胆固醇处理前获得的初始对照反应；而在1 μM辣椒素条件下，两次反应的幅度相似。为了量化，将第一次辣椒素反应的最大电流幅度定义为I_max，第二次反应的最大电流相对于该值表示。这些结果表明，升高的膜胆固醇抑制辣椒素诱导的TRPV1活性取决于辣椒素水平，反映为在使用低浓度（而非高浓度）辣椒素的实验中，第二次辣椒素反应的电流幅度降低。

对接分析鉴定出TRPV1中两个潜在的胆固醇结合口袋。第一个是位于蛋白质-膜界面的S1-S2螺旋之间的裂隙；第二个是由两个亚基之间形成的口袋，其中一个亚基的S5-S6螺旋与相邻亚基的S4螺旋和S4-S5接头相互作用。冷冻电镜先前已鉴定出香草素类分子的类似结合口袋。基于这些结构研究，研究者将这个亚基间区域作为假定的胆固醇相互作用位点。胆固醇和辣椒素之间的功能相互作用通过定点诱变Gly563进一步评估，这是香草素结合口袋S4-S5接头中的一个保守残基。对接分析鉴定出该残基位于预测的胆固醇结合区域内，鉴于其在所有TRPV和TRPC家族成员中的保守性，使其特别值得关注。先前在表达同源mTRPV1^G564S突变体的小鼠中的研究已证明其炎症性热痛反应受损、辣椒素敏感性降低以及组胺诱导的瘙痒减弱。类似地，在HEK细胞中异源表达rTRPV1^G563S导致基础电流增加、辣椒素敏感性降低、激活动力学变慢以及电流失活不完全。为了检验胆固醇富集对rTRPV1^G563S功能的影响，对瞬时表达该突变通道的T-REx?-293细胞进行了全细胞记录。表达rTRPV1^G563S的细胞显示出对辣椒素的敏感性降低。因此，测量使用1 μM辣椒素进行，随后在洗脱激动剂后，用MβCD:胆固醇溶液灌流。有趣的是，表达rTRPV1^G563S的细胞既表现出辣椒素敏感性降低，又在激动剂洗脱期间表现出持续的电流。引人注目的是，这种持续的TRPV1依赖性电流被随后MβCD:胆固醇的灌流所抑制，这支持了胆固醇对辣椒素诱导电流的抑制作用。由于Gly563被预测位于假定的胆固醇结合口袋内，这些结果强烈表明香草素结合口袋与TRPV1通道内的胆固醇结合口袋存在共定位。

先前的研究已经鉴定出一种常驻脂质，很可能是一种磷脂酰肌醇物种，占据了TRPV1非结合状态下辣椒素结合的位置，其通过肌醇头基与S4-S5接头进行极性相互作用。然而，人源TRPV1与SAF312复合物的冷冻电镜结构，连同对接分析以及本研究的功能数据表明，胆固醇在香草素结合口袋内的定位与这些早期研究中提出的假定的磷脂酰肌醇物种非常相似。总之，本研究的数据支持一种机制，即辣椒素和胆固醇在TRPV1的香草素结合口袋内竞争，胆固醇结合稳定了通道的关闭构象，而其被辣椒素取代则使得通道能够被激活。

数据可用性声明

PDB ID：3J9J 。