应用非靶向代谢组学技术探究异维A酸对HaCaT细胞代谢调控机制的研究

《Drug Design, Development and Therapy》：Untargeted Metabolomics Investigating the Intracellular Metabolic Alterations of HaCaT Cells Treated with Isotretinoin

本文创新性采用UHPLC-Q-TOF/MS非靶向代谢组学方法，系统分析异维A酸（Isotretinoin）对人永生化角质形成细胞（HaCaT细胞）代谢网络的调控作用，揭示了该药物通过干扰核苷酸代谢、嘌呤代谢、ABC转运蛋白及甘油磷脂代谢等关键通路抑制细胞增殖的潜在分子机制，为阐明其皮肤作用机理及粘膜皮肤不良反应提供了新的代谢层面的科学依据。

　　

研究背景与目的

异维A酸（13-顺式维A酸）是源自β-胡萝卜素的第一代非芳香族类维生素A衍生物，自1982年被批准用于痤疮治疗以来，其临床应用已扩展至玫瑰痤疮、脂溢性皮炎等多种皮肤病。然而，该药在发挥疗效的同时，常伴随皮肤干燥、红斑、唇炎等粘膜皮肤不良反应，其对皮肤尤其是表皮层的作用机制尚不完全清楚。既往研究表明，异维A酸可能通过影响角质形成细胞的增殖、分化及水通道蛋白3（AQP3）表达等途径发挥作用，但尚未有研究从细胞内代谢层面系统揭示其作用机制。因此，本研究旨在运用非靶向代谢组学技术，探究异维A酸处理HaCaT细胞后引发的细胞内代谢变化，从代谢物水平阐明其对角质形成细胞的作用机制。

材料与方法

研究采用人永生化角质形成细胞HaCaT细胞系，使用含10%胎牛血清（FBS）的高糖DMEM培养基进行培养。首先通过CCK8实验评估不同浓度异维A酸（0、1、5、10 μM）处理48小时后对细胞增殖的影响。随后，将细胞分为三组：A组（对照组）、B组（10 μM异维A酸处理48小时）、C组（10 μM异维A酸处理7天），每组设置8个生物学重复。

样品制备时，细胞经预冷PBS清洗后，使用甲醇/乙腈/水（2:2:1, v/v/v）混合溶剂进行代谢物提取，并经超声、离心、真空浓缩等步骤处理后，用乙腈/水（1:1, v/v）复溶。代谢组学分析采用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱联用系统（UHPLC-Q-TOF/MS），在正负离子模式下进行。色谱分离使用ACQUITY UPLC BEH Amide色谱柱，流动相为含25 mM乙酸铵和25 mM氢氧化铵的水溶液（A相）与乙腈（B相）。质谱参数设置如下：离子源气体1和2均为60，气帘气30，源温度600°C，电喷雾电压±5500 V，质量扫描范围m/z 60–1000 Da。

原始质谱数据经ProteoWizard MSConvert转换为MzXML格式后，使用XCMS软件进行峰提取、对齐和注释。通过偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）等多变量统计分析筛选差异代谢物，筛选标准为变量重要性投影（VIP）> 1且P< 0.05。差异代谢物通过比对其精确分子量（<10 ppm误差）和二级质谱图，与HMDB、KEGG等数据库进行鉴定。最后利用KEGG数据库和MetaboAnalyst平台进行通路富集分析。

实验结果

异维A酸抑制HaCaT细胞增殖

CCK8实验结果显示，异维A酸以剂量依赖性方式抑制HaCaT细胞增殖。与对照组相比，1 μM、5 μM和10 μM异维A酸处理48小时后，细胞增殖抑制率分别为21.3 ± 6.32%（P= 0.652）、29.57 ± 5.15%（P= 0.002）和40.14 ± 2.88%（P< 0.001）。

代谢轮廓多变量分析显示明显组间分离

主成分分析（PCA）显示，第一主成分（PC1）和第二主成分（PC2）分别解释了总变异的26.3%和16.2%，且质量控制（QC）样本紧密聚集，表明分析系统稳定可靠。PCA与OPLS-DA模型均清晰显示B组与A组、C组与A组之间存在明显的代谢轮廓分离。模型验证参数表明模型拟合度与预测能力良好（B组 vs A组：R²Y = 0.972，Q²= 0.88；C组 vs A组：R²Y = 0.994，Q²= 0.949）。

差异代谢物鉴定与分类

与A组相比，B组共鉴定出115个显著差异代谢物（43个上调，72个下调），主要包括甘油磷酸胆碱、腺苷、乙酰肉碱、肌酸、DL-乳酸、次黄嘌呤、尿嘧啶、LPC 18:1、磷酸肌酸、5′-S-甲基-5′-硫代腺苷等。这些代谢物按化学分类，脂质和类脂分子占比最高（35.96%），其次为有机酸及其衍生物（21.93%）、核苷、核苷酸及其类似物（13.16%）以及有机杂环化合物（11.40%）。

C组与A组相比，鉴定出140个显著差异代谢物（81个上调，59个下调），包括甘油磷酸胆碱、烟酰胺、肌酸、植物鞘氨醇、油酸、次黄嘌呤、1-棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱、DL-乳酸、5′-S-甲基-5′-硫代腺苷和N^G,N^G-二甲基-L-精氨酸等。其化学分类占比与B组相似，脂质和类脂分子（32.86%）、有机酸及其衍生物（20.00%）占据主要部分。层次聚类热图进一步直观展示了各处理组与对照组在代谢物表达水平上的显著差异。

代谢通路富集分析揭示核心调控网络

KEGG通路富集分析发现，与A组相比，B组有30条代谢通路发生显著改变（P< 0.05），其中最显著的通路包括嘌呤代谢、核苷酸代谢、ABC转运蛋白、牛磺酸和亚牛磺酸代谢以及cGMP-PKG信号通路。

C组则有46条代谢通路发生显著改变，最显著的通路包括核苷酸代谢、ABC转运蛋白、嘌呤代谢以及甘油磷脂代谢。

讨论

研究结果表明，异维A酸对HaCaT细胞的作用机制在短期（48小时）和长期（7天）处理中存在异同。核苷酸代谢和嘌呤代谢在48小时和7天处理组中均受到显著干扰，提示它们在异维A酸作用机制中扮演核心角色。核苷酸是细胞增殖所必需的代谢物，参与DNA复制和RNA合成。异维A酸通过激活维A酸受体（RAR）/维A酸X受体（RXR）可能影响此通路，从而抑制角质形成细胞增殖。研究中共发现7个与嘌呤代谢相关的代谢物发生显著变化，包括腺苷一磷酸（AMP）、次黄嘌呤、尿酸、肌苷等，表明异维A酸同时影响了嘌呤的合成与降解过程。

ABC转运蛋白通路在两个时间点均显著改变。ABC转运蛋白在角质形成细胞中参与脂质转运、屏障形成、药物代谢及应激反应等多种功能。此前研究已在痤疮患者和动物模型中观察到该通路的改变，因此异维A酸对ABC转运蛋白的调控可能与其治疗痤疮的疗效相关。

值得注意的是，甘油磷脂代谢通路仅在长期处理（7天）的C组中发生显著改变。甘油磷脂是细胞膜脂质双分子层的基本成分，参与细胞信号传导和代谢。研究中发现的甘油-3-磷酸、磷酸乙醇胺、胞苷-5′-二磷酸乙醇胺、磷酸胆碱、甘油磷酸胆碱等7个相关代谢物水平下降，表明长期异维A酸处理可能通过抑制这些膜脂前体或组分的合成，影响细胞膜的结构与功能，这或许是长期用药导致皮肤干燥等不良反应的代谢基础之一。

结论

本研究首次通过UHPLC-Q-TOF/MS非靶向代谢组学技术，系统揭示了异维A酸处理HaCaT角质形成细胞后引发的细胞内代谢重编程。研究共鉴定出115个（48小时）和140个（7天）显著差异表达的代谢物，并发现异维A酸通过调控核苷酸代谢、嘌呤代谢、ABC转运蛋白以及甘油磷脂代谢等多条关键通路，影响角质形成细胞的增殖与功能。这些发现为在代谢物水平上阐明异维A酸对皮肤的作用机制及其引起的粘膜皮肤不良反应提供了新的见解。本研究也存在一定局限性，例如使用了永生化细胞系而非原代角质形成细胞、缺乏靶向代谢组学验证及功能实验等，未来需进一步研究予以确认和深化。