《Drug Design, Development and Therapy》：Preclinical Assessment of HLA-A*02:01-Restricted PSMA and STEAP1 Epitopes for Peptide-Based Immunotherapy in Prostate Cancer
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本研究通过计算预测结合体外实验验证，系统评估了源自前列腺癌抗原PSMA与STEAP1的HLA-A*02:01限制性CTL（细胞毒性T淋巴细胞）表位。结果表明，表位ALFDIESKV（PSMA）与FLYTLLREV（STEAP1）展现出最强的HLA结合力、结构稳定性及激发多能性CD8+T细胞应答的能力，为开发基于纳米递送的肽段疫苗或过继性T细胞疗法提供了关键的临床前依据。
Abstract
本研究评估了从前列腺癌相关抗原六跨膜前列腺上皮抗原1（STEAP1）和前列腺特异性膜抗原（PSMA）中衍生的免疫原性候选表位，采用临床前方法评估了HLA-A*02:01限制性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）表位的抗原性、保守性和蛋白酶体加工潜力。
背景
前列腺癌（PC）是全球男性中发病率第二高、癌症相关死亡率第五高的主要健康问题。局部性前列腺癌可通过根治性前列腺切除术和放疗等干预手段控制，但转移性和去势抵抗性前列腺癌（CRPC）的出现带来了严峻的治疗挑战。尽管在系统性治疗（如紫杉烷类化疗和雄激素受体靶向药物）方面取得了进展，但大多数患者仍不可避免地出现耐药和疾病进展。在此背景下，癌症免疫疗法已成为恢复和增强肿瘤免疫监视的有力策略。其中，肽段疫苗代表了一种合理且安全的选项，能够刺激CTL选择性清除肿瘤细胞，同时保留健康组织。这类疫苗通过引入短的、MHC I类限制性表位来激活CD8+T细胞，其成功关键在于识别同时具有免疫原性和肿瘤特异性的肿瘤相关抗原（TAA）。前列腺特异性膜抗原（PSMA，亦称为FOLH1或GCPII）和六跨膜前列腺上皮抗原1（STEAP1）是两种备受关注的TAA。PSMA是一种II型跨膜糖蛋白，在局部性和转移性前列腺癌中均上调表达，已是影像学和治疗应用的有效靶点。STEAP1是一种膜结合的金属还原酶，在侵袭性前列腺癌中频繁过表达，并促进肿瘤进展。它们的高肿瘤特异性、有限的正常组织表达和膜可及性使其成为CTL表位定位和靶向免疫疗法的理想候选者。
方法
本研究利用免疫信息学预测、分子对接和实验验证的综合工作流程，筛选和评估了HLA-A02:01限制性CTL表位。序列和三维结构数据从UniProt和蛋白质数据库（PDB）获取。使用NetMHCpan 4.1预测具有高HLA-A02:01结合亲和力的9聚体肽段，筛选标准为百分位排名≤0.5%。使用VaxiJen v2.0评估抗原性（阈值≥0.5），使用IEDB保守性分析工具评估表位保守性，并使用NetChop 3.0评估蛋白酶体加工潜力。通过PyMOL处理HLA-A02:01（PDB ID：1QEW）的结构，并使用PEP-FOLD3服务器生成预测肽段的三维模型。随后使用HPEPDOCK网络服务器进行肽段-MHC分子对接。筛选出的表位由金斯瑞公司合成（纯度>95%），并利用圆二色（CD）光谱进行结构表征。使用HLA-A02:01转基因小鼠（HHD品系）进行体内免疫原性验证。通过ELISA法评估肽段与HLA-A*02:01的结合亲和力，使用IFN-γ ELISpot和细胞内因子染色（ICS）分析肽段刺激的脾细胞产生的IFN-γ应答和CD8+T细胞活化。
结果
从STEAP1和PSMA的全长序列中，通过多层过滤标准（结合亲和力、免疫原性、抗原性、表面可及性和序列保守性）筛选出四个顶级表位：来自STEAP1的FLYTLLREV（P1）和AVLHAIYSL（P2），以及来自PSMA的ALFDIESKV（P3）和MMNDQLMFL（P4）。所有四个肽段均被VaxiJen确认为抗原性，且具有高序列保守性和高效的蛋白酶体加工潜力。
分子对接模拟显示，所有四种肽段都能较好地嵌入HLA-A*02:01的肽结合沟槽中。其中，FLYTLLREV（P1）表现出最强的结合姿态，对接得分为-246.57，其次是AVLHAIYSL（-239）、MMNDQLMFL（-232.26）和ALFDIESKV（-216.37）。CD光谱证实，FLYTLLREV和ALFDIESKV呈现α螺旋构象的特征，而AVLHAIYSL和MMNDQLMFL则显示出混合的二级结构。
ELISA结合实验证实，所有四种肽段均以剂量依赖的方式与重组HLA-A*02:01结合。其中，ALFDIESKV（P3）和FLYTLLREV（P1）在低至5 μM的浓度下表现出最强的结合能力，OD值超过阳性对照肽。而AVLHAIYSL（P2）和MMNDQLMFL（P4）在较高浓度（20–50 μM）下表现出中等结合能力。
IFN-γ ELISpot分析显示，ALFDIESKV（P3）和FLYTLLREV（P1）诱导了最强的抗原特异性反应，每105个脾细胞产生的斑点形成单位（SFU）分别为185 ± 12.3和162 ± 10.8，显著高于未刺激对照组（15 ± 2.1 SFU）和无关肽对照组（22 ± 3.4 SFU）。AVLHAIYSL（P2）和MMNDQLMFL（P4）产生了中度但统计学上显著的反应。
流式细胞术进行的细胞内因子染色分析进一步证实了肽段特异性CD8+T细胞的活化。ALFDIESKV（P3）和FLYTLLREV（P1）诱导了显著升高的IFN-γ+CD8+T细胞频率（分别为7.4% ± 0.5%和6.8% ± 0.7%），并且显著富集了同时表达IFN-γ和TNF-α的多功能CD8+T细胞。AVLHAIYSL（P2）和MMNDQLMFL（P4）诱导的细胞因子产生CD8+T细胞频率较低，多功能群体占比低于3%。
综合免疫原性分析的热图汇总了五个核心参数：对接得分、ELISA结合力（OD）、IFN-γ ELISpot反应、CD8+IFN-γ+T细胞百分比和TNF-α共表达。该分析一致地将P1（FLYTLLREV）确定为最强的结构结合剂，将P3（ALFDIESKV）确定为最有效的功能表位。
讨论
本研究通过结合计算机预测、结构分析、体外结合实验和体内免疫原性评估，确定了四个有前景的HLA-A02:01限制性CTL表位。严格的筛选过程与表位选择的最佳实践相一致。采用的HHD HLA-A02:01转基因小鼠模型被广泛用于人类HLA限制性表位的临床前筛选。研究结果与先前证明PSMA和STEAP1作为免疫原性靶点可行性的报告一致。CD光谱和分子对接模拟证实了所选表位与MHC I类分子结合的结构适宜性。ELISA结合实验、ELISpot功能分泌和ICS多功能性数据的整合呈现了表位性能的一致层级。更强的生化亲和力（如P1和P3所示）始终转化为增强的IFN-γ ELISpot反应和表达TNF-α的CD8+T细胞频率的增加。这种结构、生化和免疫学数据的融合，确立了ALFDIESKV（P3）和FLYTLLREV（P1）作为具有卓越转化潜力的免疫显性表位。由IFN-γ和TNF-α同时分泌所定义的强大多功能CTL反应，与越来越多的证据相一致，这些证据表明多功能T细胞在介导肿瘤控制和产生持久免疫记忆方面更优。AVLHAIYSL（P2）和MMNDQLMFL（P4）所引发的中度但显著的反应支持了肽段候选物之间存在免疫异质性的概念。这强调了多表位疫苗设计的合理性，特别是在靶向具有抗原异质性的肿瘤时。本研究的一个关键转化方面是提议将这些表位与基于纳米材料的递送平台整合。纳米颗粒如脂质体、PLGA和金基系统已被证明能够提高肽段的生物利用度，保护其免遭蛋白水解降解，并增强抗原提呈细胞（APC）的交叉提呈。我们的模型整合了抗原选择、纳米颗粒工程和CTL激活，以简化向治疗管线的转化。验证的CTL表位为开发用于前列腺癌的下一代肽段疫苗或过继性T细胞疗法奠定了坚实的基础。未来的工作可以集中于将这些表位与基于纳米材料的递送平台（如脂质体、PLGA纳米颗粒或金基载体）结合，以增强肽段的稳定性、生物利用度和向APC的靶向递送，从而最大化治疗效果。此外，将这些表位与免疫检查点抑制剂或免疫调节佐剂结合可能会进一步增强抗肿瘤反应。虽然本研究使用了转基因小鼠模型，但人源化体内模型和离体患者来源系统对于验证临床适用性和安全性至关重要。本研究的另一个限制是测试的表位数量相对较少，但这种聚焦方法允许进行严格的结构、生物物理和功能表征，为转化发展提供了高置信度的候选物。
结论
本研究成功鉴定并验证了两个高免疫原性的HLA-A02:01限制性CTL表位：源自前列腺癌相关抗原PSMA的ALFDIESKV和源自STEAP1的FLYTLLREV。通过结合免疫信息学预测、结构对接、肽段表征以及在HLA-A02:01转基因小鼠中的体内免疫原性测试的综合工作流程，这些表位表现出强大的MHC I类结合能力、结构稳定性以及激活多功能CD8+T细胞的强大能力。这些发现共同支持了它们作为基于肽段的前列腺癌疫苗或CTL导向免疫疗法的合理候选物的潜在效用。同时，我们承认需要进一步验证以增强转化相关性。未来的工作将集中于在耐受性完整的小鼠或人源化PSMA/STEAP1模型中确认肽段免疫原性，通过表面等离子共振/生物层干涉技术分析确定真实的结合动力学，并利用细胞毒性测定和肿瘤攻击模型建立功能性抗肿瘤功效。总体而言，本研究为开发针对前列腺癌的临床相关、表位驱动的免疫治疗策略提供了坚实的临床前基础。
