《Environmental Pollutants and Bioavailability》：The influence of straw and earthworms on microorganisms in the salinized soil under vertical gradient
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本研究通过90天的培养实验，揭示了秸秆与蚯蚓联合修复设施盐渍化土壤的有效性。结果表明，联合处理（SE）能显著促进表层土壤盐分向下迁移（电导率（EC）从2301.55 μS·cm?1降至959.56 μS·cm?1），并通过蚯蚓肠道富集和粪便定殖的方式，显著提升土壤各层秸秆降解菌（如鞘氨醇单胞菌属）丰度（较其他处理提高1.07-6.24倍）及表层盐敏感菌丰度。该协同策略优化了土壤盐分分布与微生物群落结构，为设施盐碱地改良提供了创新的生物修复思路。
引言
土壤盐渍化是全球性的土地退化问题。根据联合国粮农组织报告，全球盐渍土面积已达13.81亿公顷。在中国，设施农业（如温室）的快速发展导致了土壤次生盐渍化问题日益突出。温室常年覆盖导致土壤水分蒸发强烈，盐分随毛细管作用向表层富集，加之缺乏自然淋洗和高强度施肥，破坏了土壤水盐平衡，导致土壤结构破坏和养分失衡。
微生物是土壤养分平衡的核心调节者，但在盐渍化土壤中，盐分的过度积累会导致土壤微生物数量和活性下降。施加外源有机物质（如秸秆）是改善盐渍化土壤的有效手段。秸秆富含有机质和氮磷钾等养分，能为微生物提供易于利用的碳源，从而刺激与养分循环相关的微生物活性。然而，盐渍化会抑制微生物活性，使得养分难以有效释放。
为了克服这一问题，实践中常采用微生物-秸秆联合修复的方法，例如接种耐盐菌剂。但菌剂的制备和应用存在诸多问题，如保质期短、与土著微生物产生拮抗等。土壤腐生动物如蚯蚓，能够通过摄食和排泄加速秸秆残体向土壤腐殖质的转化，提高秸秆分解率，并具有通过肠道-土壤微界面的物理化学相互作用和分泌物激活耐盐微生物的功能。因此，土壤动物-微生物-秸秆的相互作用有望增强秸秆降解菌在盐渍土壤环境中的抗逆性，提升秸秆对盐渍土的改良效果。
然而，关于设施盐渍化土壤盐分迁移趋势、土壤微生物群落结构变化以及添加的蚯蚓肠道微生物群落结构变化的研究仍处于初步阶段。为此，本研究选取表层和底层生活的蚯蚓（威廉环毛蚓）作为试验蚯蚓，采用高通量微生物群落分析（16S rRNA测序）方法，旨在阐明在仅添加秸秆、仅添加蚯蚓以及两者联合添加的处理下，90天内土壤柱各层盐分的迁移规律；分析不同处理、不同土壤层次和不同实验时期，土壤中秸秆降解菌和盐敏感菌相对丰度的变化；探究蚯蚓肠道微生物的多样性及其秸秆降解菌组成的差异，揭示秸秆与蚯蚓联合添加对土壤和蚯蚓肠道微生态系统的调控效应；通过分析土壤微生物共生网络的复杂性和稳定性，结合土壤与蚯蚓肠道功能微生物之间的相关性，阐明蚯蚓肠道作为秸秆降解菌富集位点及其通过蚯蚓粪便在土壤中定殖的过程，厘清秸秆-蚯蚓协同改善土壤盐分分布和微生物群落结构的内在机制。
材料与方法
试验土壤采集自连续种植10年的崇明东滩葡萄设施温室，并按0-10厘米（表层）、10-30厘米（中层）、30-50厘米（底层）分层。所用秸秆为稻草，粉碎成0.5-1厘米小段。试验蚯蚓为上海本地常见种威廉环毛蚓。试验装置为定制的带漏底的有机玻璃柱。
试验于2023年2月至5月在温室中进行。设置4个处理组：空白对照组（CK）、添加0.6千克/平方米威廉环毛蚓组（E）、添加2%秸秆组（S）、添加2%秸秆+0.6千克/平方米威廉环毛蚓组（SE），每组3个重复。试验期间，每天检测土壤含水量，并维持在田间持水量的60%-70%。
分别在试验的第30、60、90天，按“五点采样法”分层采集土壤样品。同时，在添加蚯蚓的处理组（E和SE）中，采集蚯蚓肠道内容物。土壤电导率（EC）采用电导法测定。所有用于微生物分析的样品均送至上海美吉生物医药科技有限公司进行16S rRNA基因V3-V4区扩增子测序。使用Fastp进行质控，FLASH合并序列，QIIME2中的DADA2进行去噪生成ASV。使用Mothur计算ACE、香农指数等Alpha多样性指数，使用R语言的Vegan包基于Bray-Curtis距离进行主坐标分析（PCoA），使用MENA进行共生网络分析并使用Gephi可视化。
结果
3.1 不同处理对盐渍化土壤盐分含量的影响
所有处理均表现出一致的趋势：土壤电导率在表层降低，在中层略有增加，在底层显著增加。与CK处理相比，秸秆+蚯蚓处理（SE）在表层的电导率降低最为显著。至第90天，SE处理表层土壤电导率降至959.56 μS·cm?1，较初始值下降58.31%，降幅高于其他处理。盐分向下迁移，导致中层和底层土壤电导率分别较初始值增加了84.12%和129.33%。
3.2 土壤微生物Alpha和Beta多样性分析
在所有三个土壤层次中，SE处理的ACE指数和香农指数始终高于其他处理组，表明联合处理显著提高了土壤微生物的丰富度和多样性。PCoA分析显示，四个处理组的微生物群落结构在所有土壤层次和采样时间点均存在显著分离，表明蚯蚓和秸秆显著改变了微生物群落结构。SE组与CK组的分离最为明显，突出了秸秆和蚯蚓对微生物群落重构的协同效应。
3.3 不同处理下土壤微生物群落共生网络分析
基于ASV相对丰度构建微生物共生网络。添加蚯蚓的处理组（E和SE）的网络复杂度显著高于CK组和仅添加秸秆组（S）。网络关键指标显示，中层土壤的节点数、边数、平均度和模块化系数高于表层和底层，表明中层微生物相互作用更复杂、群落结构更紧密。在SE组中，共生网络中正相关和负相关连接的比例基本相等，而其他处理则表现出不平衡的比例，表明秸秆-蚯蚓修复可以平衡土壤微生物间的正负相关性，使整个土壤微生物共生网络处于动态平衡。
3.4 不同处理下微生物群落结构及优势物种
在属水平上，芽孢杆菌属是所有三个土壤层次中最丰富的菌属。此外，鞘氨醇单胞菌属在三个土层中也占比较高。经过90天实验，其相对含量随时间增加，其中SE处理增幅最显著、比例最高。盐微生物属是一种嗜盐细菌，在表层和中间层土壤中均被检测到。经过90天的秸秆和蚯蚓联合修复后，其在表层的相对含量从CK处理的1.04%显著下降至0.52%。
与秸秆降解相关的细菌属（如鞘氨醇单胞菌属、德沃斯菌属、土地杆菌属、微泡菌属等）在SE处理组三个土层的丰度均高于CK、E和S组。例如，在实验结束时（第90天），SE处理表层土壤中这些菌属的丰度是其他三组的1.08-6.01倍。
同样，盐敏感细菌属（如假黄单胞菌属、寡养单胞菌属、芽单胞菌属）在SE处理组三个土层的丰度也高于CK组。沿垂直梯度，这些盐敏感菌属的丰度变化趋势与盐分迁移一致：在表层增加，在中层略有下降，在底层显著下降。
3.5 蚯蚓肠道内容物多样性及共生网络分析
SEg组（饲喂秸秆的蚯蚓肠道）的ACE指数和香农指数高于Eg组（未饲喂秸秆的蚯蚓肠道），且在第90天差异最显著。PCoA分析显示，Eg和SEg在第30、60、90天的微生物群落存在显著分离。
基于ASV相对丰度对蚯蚓肠道微生物进行共生网络分析，SEg处理组的网络参数（节点数、边数、平均度、模块化系数）均高于Eg处理组。SEg的共生网络显示出两个紧密连接的微生物模块区域，关键微生物物种包括来自放线菌门的链霉菌属、来自厚壁菌门的芽孢杆菌属和来自粘球菌门的寻常杆菌属；而Eg处理组仅显示一个连接相对松散的微生物模块区域。这表明秸秆的添加使蚯蚓肠道内微生物物种间的相互作用关系更加复杂，群落构建更加紧密。
3.6 不同处理下蚯蚓肠道微生物群落结构及优势物种
3.6.1 群落组成分析
在实验期间，SEg组关键菌属的相对丰度高于Eg组：芽孢杆菌属（1.47-2.43倍）、链霉菌属（7.81-27.62倍）、类芽孢杆菌属（1.28-5.31倍）和类芽孢杆菌属（1.01-4.82倍）。
与秸秆纤维素、木质素等组分降解能力相关的细菌属，在SEg组中的相对丰度也高于Eg组。例如，链霉菌属、堆囊菌属、微泡菌属、类芽孢杆菌属和丝状杆菌属在SEg组的相对丰度，在第30、60、90天分别比Eg组增加了4.22-16.85倍、1.36-11.89倍和1.35-7.73倍。
3.6.2 微生物关联分析
相关性热图显示了土壤（y轴）和蚯蚓肠道（x轴）中纤维素降解菌在垂直层次上的关联。总体而言，肠道纤维素降解菌对其土壤对应菌属的影响随土壤深度增加而减弱，在表层相关性最强。土壤中的德沃斯菌属显著受到肠道中五个纤维素降解菌属的影响，而肠道中的类芽孢杆菌属也显著受到土壤中五个纤维素降解菌属的影响。在土壤表层，土壤中的微泡菌属和土地杆菌属与肠道中所有五个纤维素降解菌属均显著相关。
讨论
每日浇水导致所有处理组（包括CK）的表层土壤电导率下降，中、底层电导率增加。秸秆和蚯蚓的添加显著加剧了这一趋势，其中SE处理效果最明显。秸秆的添加改善了土壤团聚体孔隙形态和粒径分布，重构了土壤孔隙系统的层次结构，通过腐殖质对土壤颗粒的胶结作用，改变了毛管孔隙的形态特征和连续性，从根本上抑制了土壤毛细管的水盐运移功能。蚯蚓通过在耕层土壤中的钻穴、摄食、消化等活动，在整个耕层土壤中构建了大孔隙通道，为水分下渗提供了优势路径。同时，蚯蚓粪作为蚯蚓消化过程的产物，富含腐殖质、多糖等有机物质，能显著增强大团聚体的稳定性，优化团聚体的微孔结构。这种由蚯蚓活动介导的土壤结构改善，强化了土壤的水分淋溶能力，加速了盐分的淋洗过程。
共生网络分析表明，添加蚯蚓（E和SE）增强了微生物相互作用的复杂性和稳定性。SE组网络中正负相关连接比例基本平衡，表明秸秆-蚯蚓修复可以使微生物群落处于动态平衡。较高的模块化系数进一步证明，蚯蚓和秸秆的联合应用能使土壤微生物群落更稳定。秸秆提供了持续的碳源和养分，而蚯蚓改善了土壤结构，其分泌的粘液和蚯蚓粪中的有机质为土壤微生物生长创造了有利的微环境。
秸秆和蚯蚓改良剂均显著提高了土壤微生物丰富度和多样性，其中SE处理的协同效应最为明显。SE处理组中与秸秆降解相关的细菌属（如鞘氨醇单胞菌属、德沃斯菌属、土地杆菌属、微泡菌属等）的相对丰度高于其他三组。这些秸秆降解菌的富集直接促进了土壤有机质的转化和盐分分布的调节。它们分泌的酶能将秸秆分解为小分子有机酸和可溶性碳水化合物，这些产物不仅能作为其他土壤微生物的能源，还能通过螯合作用降低盐分离子的生物有效性，抑制其通过毛细作用向上迁移。同时，盐敏感细菌属（如假黄单胞菌属、寡养单胞菌属、芽单胞菌属）的丰度变化模式反映了盐分胁迫与其他调节因素之间的平衡。在表层，盐分的显著降低直接缓解了对这些类群的抑制作用，导致其丰度大幅增加。在中层，尽管盐分有所增加，但由于SE处理带来的秸秆分解产物和蚯蚓粪源腐殖质提供了营养丰富的微环境，以及改善的土壤结构增强了氧气可用性，这些正面因素部分抵消了盐分增加的抑制作用，使其丰度下降较为缓和。
对蚯蚓肠道微生物群的研究发现，秸秆摄入显著改变了微生物多样性。SEg组的香农指数和Beta多样性变化均高于Eg组。共生网络分析显示SEg组具有更强的拓扑参数和更紧密的群落组装。同时，秸秆摄入显著提高了纤维素和木质素降解微生物的丰度。相关性分析显示，肠道和土壤中的纤维素/木质素降解功能微生物群之间存在显著正相关。尽管本研究无法确定肠道与土壤微生物群之间的因果方向，但其他结果间接证明了蚯蚓肠道微生物群对土壤微生物群具有相互协作效应：在同一时间段内，具有纤维素和木质素降解能力的菌属在SEg中的富集程度高于Eg，而相同功能菌属在SE处理土壤中的相对丰度始终高于CK、E和S处理；此外，作为肠道微生物群落转移的主要载体，蚯蚓粪富含腐殖质，为微生物定殖提供了有利的微环境，SE处理中土壤微生物共生网络的复杂性增加也表明了这一点。
肠道与土壤微生物之间关联的潜在机制可能涉及两个关键过程：蚯蚓肠道内的选择性富集和蚯蚓粪的高效定殖。首先，蚯蚓肠道是秸秆降解菌的特定生态位。蚯蚓摄食过程中的机械研磨将秸秆破碎成细小颗粒，增强了秸秆与蚯蚓肠道微生物的接触。蚯蚓肠道的微环境为纤维素/木质素降解类群提供了最佳的生长条件，并提高了秸秆降解菌的代谢活性。同时，蚯蚓粪作为肠道微生物群落的主要载体，通过排泄进一步促进了秸秆降解菌在土壤中的定殖。此外，蚯蚓粪和蚯蚓自身的物理扰动改变了土壤团聚体结构，减轻了盐分对盐渍土中盐敏感微生物的胁迫风险。
结论
在本研究条件下，添加秸秆和蚯蚓促进了设施盐渍土壤中盐分离子从表层向中、底层的迁移；调控了微生物群落结构的垂直剖面；缓解了盐分对盐敏感类群的胁迫；并使得各土层微生物群落的共生网络更加紧密、复杂和模块化，微生物类群间呈现动态平衡关系。此外，蚯蚓肠道为秸秆降解菌的富集提供了生态位，这些菌随蚯蚓粪在土壤中定殖。然而，肠道与土壤微生物群之间的因果关系需要通过针对性实验加以验证。
本研究为在设施盐渍土修复中耦合土壤腐生动物与秸秆提供了一种有前景的途径。鉴于修复效果可能受到蚯蚓种类和种群密度、土壤盐分程度、质地、水分状况和肥力状况等多种变量的影响，未来研究应量化淋洗效率、微生物群落响应与蚯蚓密度、土壤质地等关键因素之间的关系，以优化该修复策略的应用参数。
尽管土柱实验旨在通过原状回填保持自然土壤结构，但仍存在一定局限性。尽管如此，这项工作从土壤动物-微生物-有机质相互作用的角度，阐明了秸秆-蚯蚓一体化修复的微生物机制，揭示了动物活动如何增强盐渍环境中微生物网络的稳定性和功能恢复力。这些发现为理解和完善基于生物技术的盐渍化土壤修复方案提供了理论基础。未来的研究应将原状土柱实验与长期田间试验相结合，以提高该方法的实用性和可扩展性。
