《Analytica Chimica Acta》：Molecularly imprinted polymer nanoparticle-based sequential competitive fluorescence assay for serum ferritin assessment
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血清铁蛋白检测的分子印迹聚合物纳米颗粒竞争荧光法研究。本研究采用固体相位印迹技术合成nanoMIPs，通过竞争荧光法实现铁蛋白的微量检测，检测范围5.10-800 ng/mL，准确度98-109%，对其他蛋白交叉反应率低至2-7%。实验验证了该方法与化学发光法高度相关性（R2=0.9873），为临床铁蛋白检测提供新方案。
作者名单：Sanita Singsanan、Thanet Prajantasen、Rungthiwa Niamlaoong、Soemwit Khongwichit、Maliwan Srisuk、Peter A. Lieberzeit、Suticha Chunta
泰国春武里府Burapha大学联合健康科学学院医学技术系，邮编20131
摘要
背景
铁蛋白是一种指示体内铁储备量的蛋白质，在诊断缺铁性贫血和评估铁过载方面至关重要。免疫测定法依赖于抗铁蛋白抗体与铁蛋白抗原之间的选择性相互作用，目前有多种实现方法。然而，这种基于免疫的方法存在试剂（如抗体、酶）有效期短和成本较高的局限性。本研究开发了一种基于分子印迹聚合物纳米颗粒（nanoMIPs）的序列竞争荧光测定法，用于检测血清/血浆中的微量铁蛋白。
结果
通过固相分子印迹技术，以铁蛋白为模板合成了纳米MIPs，其水动力直径为202 ± 16纳米。在所开发的序列竞争荧光测定法中，首先让样品中的未标记铁蛋白与纳米MIPs结合，随后加入荧光素5(6)-异硫氰酸酯标记的铁蛋白（FITC-铁蛋白），两者竞争纳米MIPs上剩余的结合位点。FITC-铁蛋白与纳米MIPs结合后，通过光诱导电子转移机制导致FITC荧光减弱。实验中纳米MIPs的浓度保持为4 mg/mL，同时改变样品中的铁蛋白浓度（最高至60 μM FITC-铁蛋白）。纳米MIPs在60 μmol/L FITC-铁蛋白存在下15分钟内即可完成结合。该测定法的线性范围为5.10至800 ng/mL，回收率准确率为98%至109%，重复性变异系数为2.02%至9.63%。纳米MIPs对铁蛋白具有高度选择性，与其他血清蛋白（如脂蛋白、人血清白蛋白和免疫球蛋白）的交叉反应率较低（2%至7%）。
意义
使用基于纳米MIPs的序列竞争荧光测定法分析人血浆的结果与化学发光免疫测定法高度一致（R2 = 0.9873）。这项研究满足了临床环境中微量铁蛋白定量检测的需求，拓展了纳米MIPs在竞争荧光测定中的应用潜力。
引言
铁是红细胞血红蛋白的重要组成部分，红细胞生成与铁稳态之间存在直接关联[1]。虽然肝活检是评估体内铁含量的金标准方法，但由于肝脏内铁分布不均，该方法可能产生误差[2]。铁蛋白是一种中空球形蛋白质，通过以铁离子形式储存铁来调节体内铁平衡。血清铁蛋白水平常用于衡量体内铁的积累量，其水平与铁储备量成正比。世界卫生组织（WHO）建议成年女性的血清铁蛋白水平不应超过150 ng/mL，男性不应超过200 ng/mL；低于15 ng/mL提示缺铁[3]。血清铁蛋白水平可用于诊断因铁利用不足引起的缺铁性贫血。在疾病初期，血清铁蛋白水平会先下降，随后才出现贫血症状。该测定法还可用于评估铁过载、筛查献血者是否缺铁[4]、评估地中海贫血治疗效果[5]以及癌症患者的预后[6][7]。多种实验室方法可用于测量铁蛋白浓度，但各有优缺点（如免疫测定法依赖抗铁蛋白抗体与铁蛋白抗原的选择性相互作用）。然而，免疫方法的试剂（如抗体、酶）有效期短且成本较高。本研究开发的分子印迹聚合物纳米颗粒（nanoMIPs）作为荧光测定法的特异性成分，可实现铁蛋白的灵敏度和选择性检测。与天然抗体相比，nanoMIPs具有更强的选择性、更低的交叉反应性，并且在更宽的温度和pH范围内稳定，无需特殊储存条件[9]。
本研究利用纳米MIPs开发了一种新型荧光测定方法，能够在低浓度下准确检测铁蛋白。NanoMIPs的合成采用固相分子印迹技术，具有较高的表面积和更易接近的结合位点，从而提高了检测效率。纳米MIPs的合成策略包括沉淀聚合、乳液聚合、核壳结构和固相印迹等[10-14]。其中，沉淀聚合因操作简单且无需表面活性剂而广泛应用，但可能导致结合位点分布不均、模板去除效率低及颗粒大小控制不佳[12,13]。固相印迹技术能够精确控制结合位点的形成，生成的nanoMIPs具有高亲和力、高结合位点均匀性和优异的可重复性[15-17]。本研究选择硅胶作为固相印迹载体，因其具有大表面积、丰富的羟基官能团和成熟的硅烷化学修饰技术，可实现高效且可控的模板固定[17]。虽然玻璃珠在化学性质上与硅胶相似，但表面积较小、颗粒较大，限制了模板负载量和纳米MIPs的产量[18]。磁性纳米颗粒虽适用于快速分离，但可能存在聚集问题，影响结合位点的均匀性和重复性[19]。NanoMIPs可合成用于多种化合物（如小分子、蛋白质、脂蛋白和微生物）的印迹，表现出优于天然抗体的性能（如更高的化学和生物稳定性）[20-24]。它们已在多种生物测定法中替代抗体，如氧化低密度脂蛋白[23]和万古霉素[25]的检测，以及苯丙帕特林[27]的荧光免疫测定。
化学物质与试剂
N-乙烯基吡咯烷酮（NVP）、甲基丙烯酸（MAA）、硅胶、乙醇、氢氧化钠（NaOH）和氯化钠（NaCl）购自Merck（德国）。铁蛋白、人血清白蛋白（HSA）、N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺盐酸盐（APMA）、过硫酸铵（APS）和氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES）来自Sigma-Aldrich（德国）。荧光素5(6)-异硫氰酸酯（FITC）由MedChemExpress（美国）提供。四甲基乙烯二胺（TEMED）等试剂也用于实验。
纳米MIPs的合成
图1显示了硅胶/APTES/GA、硅胶/APTES/GA/铁蛋白及硅胶/APTES/GA/铁蛋白/纳米MIPs的FTIR光谱。SiO?表面经APTES和GA修饰后，分别在798 cm?1和1092 cm?1处出现特征峰，对应硅胶中的Si-O-Si伸缩振动；974 cm?1处的峰为Si-OH伸缩振动；1572 cm?1和3444 cm?1处的峰分别对应SiO?-NH?和N-H的弯曲振动。
结论
纳米MIPs能快速与铁蛋白结合，并在存在其他血清蛋白的情况下仍保持选择性识别。将其应用于序列竞争荧光测定法后，显著提高了铁蛋白检测的灵敏度。该方法在5.10–800 ng/mL范围内对铁蛋白呈现线性响应，准确性和重复性均令人满意。
作者贡献声明
Thanet Prajantasen：负责撰写、审稿与编辑、资料准备、方法设计及实验实施。Peter A. Lieberzeit：负责撰写、审稿与编辑、资料准备、方法设计及实验实施。Maliwan Srisuk：负责撰写、审稿与编辑、方法设计。Soemwit Khongwichit：负责撰写、审稿与编辑、方法设计。Rungthiwa Niamlaoong：负责撰写、审稿与编辑、方法设计。Suticha Chunta：负责撰写、审稿与编辑、初稿撰写、验证、项目监督、资料准备及方法设计。资助
本项目由泰国宋卡王子大学资助（项目编号：MET6402023S）。本研究得到了东盟-欧洲学术大学网络（ASEA-UNINET）、奥地利联邦教育科研部（BMBWF）及奥地利教育与国际化署（OeAD）的支持。
